氨甲酰妥布霉素高产菌株选育及其发酵特性研究.docx

氨甲酰妥布霉素高产菌株选育及其发酵特性研究【摘要】目的筛选氨甲酰妥布霉素高产菌株并稳定其发酵效价。方法以黑暗链霉菌Ts228为出发菌株，经自然分离，UV诱变结合耐自身代谢产物处理，采用琼脂块法并结合摇瓶发酵来筛选高产菌，获得了Tt49新菌株。以摇瓶发酵考察生长特性，罐上发酵绘制代谢曲线。结果效价提高了倍，妥布霉素含量高达%。该菌株生长周期仅4d，传代稳定。种龄18h左右，接种量10%。按照代谢曲线图进行调控，发酵罐的产抗水平达5865u/ml。结论自然分离与诱变相结合，是黑暗链霉菌选育的有效途径。出发菌株经UV诱变和耐受驯育，发酵效价显着提高。溶氧是妥布霉素发酵生产中的重要调控因子。【关键词】黑暗链霉菌；氨甲酰妥布霉素；深层发酵；抗生素ABSTRACTObjectiveScreeningahighandstablemutantstrainfromTs228forCTB(carbamoyltobramycin)production.MethodsAparentstrain(Ts228)wasisolatedbynaturalselection,thentreatedbyUV,andculturedonplatecontainingtobramycin.Finally,ahighyieldmutantTt49wasobtainedthroughseveralcyclicscreening.Itsproductivitywasdetectedinflaskandthecurvesoftypicalfermentationwereprocessedin50Lfermenter.ResultsAmutantstrainTt49wascultured.Itsfermentationtitreincreasedto5869u/mlwhichwastimeshigherthantheparentstrainTs228,andthecomponentratiooftobramycincomesupto%.ThefermentationcourseofTt49onlyneed4days.The18hseedmyceliumand10%W/Vofinoculationwereused.ConclusionsThecombinationofnaturalselectionandUVwasausefulmethodfortobramycinfromDissolvedoxygenisanimportantparameterinfermentationcondition.KEYWORDS;Tobramycin;Fermentation;Antibiotics氨甲酰妥布霉素(carbamoyltobramycin)是黑暗链霉菌(Streptomycestenebrarius)经深层发酵产生的尼拉霉素复合物5′组分，经酸或碱催化水解得到妥布霉素(tobramycin)。妥布霉素是临床上广泛使用的第二代氨基糖苷类抗生素，主要作用于细菌30S核糖体亚基，抑制菌体蛋白质的合成，广泛应用于败血症、中枢神经感染及新生儿的脓毒症等［1］，总有效率达85%以上。妥布霉素与其它抗生素联合使用，不仅可增强抗菌活性，还可扩大抗菌范围。此外，妥布霉素对第八对脑神经的耳毒性比新霉素、庆大霉素低。由于发酵效价不稳定，分离纯化困难，生产成本居高不下，销售价格昂贵，影响其普及使用。有关妥布霉素的研究活动一直很活跃，从生产菌株的改良到代谢途径的揭示，再到合成基因簇的克隆等各方面均有。沈阳药科大学采用紫外线和亚硝基胍结合耐受处理筛选妥布霉素产生菌［2，3］；丹麦科研人员利用碳标记实验考查代谢产物的通量，发现黑暗链霉菌在生长阶段ED途径活跃［4］，但未阐明安普霉素、卡那霉素B和妥布霉素的分歧代谢途径；韩国研究者于2004年从黑暗链霉菌ATCC17920中分离到妥布霉素生物合成基因簇［5］，有望给妥布霉素的生产带来质的飞跃，但阐明各个基因的功能并将其运用于工业化生产仍需一段过程。本文从菌种选育和工艺优化两方面进行研究，稳定并提高了妥布霉素工业化生产，取得了实效。1材料与方法实验材料菌种黑暗链霉菌(Streptomycestenebrarius)Ts228；枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)［CMCC(B)63501］，本实验室保藏菌。培养基(%)①斜面：葡萄糖，蛋白胨，氯化钾，FeSO4·7H2O，磷酸氢二钾，硫酸镁，琼脂，pH自然；②种子：葡萄糖，玉米淀粉，黄豆饼粉，硫酸镁，磷酸二氢钾，氯化钾，CaCl2，pH自然；③发酵：葡萄糖，玉米粉，黄豆饼粉，硫酸铵，硫酸镁，碳酸钙，硫酸锌，玉米淀粉，豆油，～。仪器生化培养箱(LRH250A)；220r/min摇瓶机(自