用于诺如病毒和轮状病毒双重RT-RAP检测的引物探针组、试剂盒及其应用.pdf

(19)国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN115927746A(43)申请公布日2023.04.07(21)申请号202210967130.7(22)申请日2022.08.12(71)申请人中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所地址102206北京市昌平区昌百路155号(72)发明人马学军申辛欣李逢钰张瑞卿田丰雨(74)专利代理机构北京高沃律师事务所11569专利代理师黄明光(51)Int.Cl.C12Q1/70(2006.01)C12Q1/6806(2018.01)C12Q1/6851(2018.01)C12N15/11(2006.01)C12R1/93(2006.01)权利要求书2页说明书10页序列表（电子公布）附图4页(54)发明名称用于诺如病毒和轮状病毒双重RT-RAP检测的引物探针组、试剂盒及其应用(57)摘要本发明提供了用于诺如病毒和轮状病毒双重RT‑RAP检测的引物探针组、试剂盒及其应用，属于分子生物学检测技术领域，所述引物探针组包括诺如病毒检测用引物探针组和轮状病毒检测用引物探针组；所以诺如病毒检测用引物探针组包括：GII‑RAA‑F、GII‑RAA‑R、GII‑F、GII‑R和GII‑P；所述轮状病毒检测用引物探针组包括：RV‑RAA‑F、RV‑RAA‑R、RV‑F、RV‑R和RV‑P。本发明的引物探针组可同时快速检测诺如病毒GII型和轮状病毒A组，灵敏度比普通qPCR高，反应时间大大缩短，且特异性好。CN115927746ACN115927746A权利要求书1/2页1.用于诺如病毒和轮状病毒双重RT‑RAP检测的引物探针组，包括诺如病毒检测用引物探针组和轮状病毒检测用引物探针组；所以诺如病毒检测用引物探针组包括：GII‑RAA‑F、GII‑RAA‑R、GII‑F、GII‑R和GII‑P；所述GII‑RAA‑F、GII‑RAA‑R、GII‑F、GII‑R和GII‑P的核苷酸序列分别如SEQIDNO.1～SEQIDNO.5所示；所述轮状病毒检测用引物探针组包括：RV‑RAA‑F、RV‑RAA‑R、RV‑F、RV‑R和RV‑P；所述RV‑RAA‑F、RV‑RAA‑R、RV‑F、RV‑R和RV‑P分别如SEQIDNO.6～SEQIDNO.10所示；所述GII‑P和RV‑P分别标记不同的荧光基团。2.根据权利要求1所述的引物探针组，其特征在于，所述荧光基团包括FAM、HEX、ROX、TET、JOE、CY3、CY5、TAMRA或VIC。3.用于诺如病毒和轮状病毒双重RT‑RAP检测的的试剂盒，包括权利要求1或2所述的引物探针组、RT‑RAA反应用试剂和qPCR反应用试剂。4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括正二十二烷。5.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述qPCR反应用试剂包括无核酶水、Buffer、Taq热启动酶和dNTP；所述RT‑RAA反应用试剂包括反应缓冲液、乙酸镁和无核酶水。6.权利要求1或2所述的RT‑RAP检测用引物探针组或权利要求3～5任意一项所述的试剂盒在非诊断目的的诺如病毒和轮状病毒同时检测中的应用。7.一种非诊断目的的诺如病毒和轮状病毒同时检测的方法，包括以下步骤：1)提取待测样品的核酸；2)以所述核酸为模板，采用权利要求1或2所述的引物探针组，依次进行RT‑RAA扩增和qPCR扩增，收集荧光信号；所述RT‑RAA扩增和qPCR扩增的扩增体系采用正二十二烷进行间隔；3)若诺如病毒对应的扩增曲线起峰且呈S型扩增，判定待测样品中含有诺如病毒，若诺如病毒对应的扩增曲线不起峰或无明显S型扩增，判定待测样品中不含诺如病毒；若轮状病毒对应的扩增曲线起峰且呈S型扩增，判定待测样品中含有轮状病毒，若轮状病毒对应的扩增曲线不起峰或无明显S型扩增，判定待测样品中不含轮状病毒；8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述RT‑RAA扩增的反应体系包括280mM的乙酸镁水溶液、模板和RT‑RAA反应混合液；所述乙酸镁水溶液、模板和RT‑RAA反应混合液的体积比为0.5：1：9；所述RT‑RAA反应混合液以40μl计，包括以下组分：反应缓冲液25μl、无核酶水11μl、GII‑RAA‑F1μl、GII‑RAA‑R1μl、RV‑RAA‑F1μl和RV‑RAA‑R1μl；所述RT‑RAA扩增的反应程序包括39～42℃、10～12min；所述qPCR扩增的反应体系以40μl计，包括以下组分：Buffer12.5μl、无核酶水22.2μl、Taq热启动酶0.5μl、dNTP0.6μl、MgCl21.2μl、GII‑F0.5μl、GII‑R0.5μl、GII‑P0.5μl、RV‑F0.5μl、RV‑R0.5μl和RV‑P0.5μl；所述qPCR扩增的反应程序包括：95℃、3mi