一种基于亲和层析柱的乌司他丁纯化方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN108059670A(43)申请公布日2018.05.22(21)申请号201711058749.1(22)申请日2017.11.01(71)申请人广东天普生化医药股份有限公司地址510520广东省广州市天河区天河高唐科技产业园高普路89号(72)发明人郑少亮王旭肖益热(74)专利代理机构北京精金石专利代理事务所(普通合伙)11470代理人刘晔(51)Int.Cl.C07K14/81(2006.01)C07K1/36(2006.01)C07K1/30(2006.01)C07K1/22(2006.01)C07K1/16(2006.01)权利要求书2页说明书9页(54)发明名称一种基于亲和层析柱的乌司他丁纯化方法(57)摘要本发明公开了一种对尿液进行预处理并结合亲和层析柱对乌司他丁进行纯化方法，该方法包括以下步骤：对尿液进行冷冻、真空及微波预处理得乌司他丁粗品，然后通过疏水柱层析、亲和层析和凝胶过滤层析对乌司他丁粗品进行纯化，最后洗涤、冻干得到总收率在90％以上，总效价6700iu/mg以上的乌司他丁，对尿液进行一定程度的预处理，结合使用层析柱纯化处理，操作简单，且优选的填料和流速等参数提高了生产效率，大大降低生产成本，适合进一步开发利用。CN108059670ACN108059670A权利要求书1/2页1.一种基于亲和层析柱的乌司他丁纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)取适量pH为4-6.5的澄清尿液，首先在氮气保护下对其进行的冷冻真空处理，在真空条件下进行微波处理，然后离心浓缩，收集浓缩尿液中加入适量壳聚糖，并用精密pH试纸调节尿液pH为4.5-6.5；吸附完全后用氨水洗脱0.5-3h,在经过2-5kg硫酸铵盐析，静置、沉淀、干燥后即得乌司他丁粗品；(2)对步骤(1)得到的乌司他丁粗品进行层析柱纯化；(3)将步骤(2)得到的层析洗脱液依次进行微滤、超滤；(4)将步骤(3)得到的超滤液离心，弃上清，将沉淀用无水乙醇洗涤，留取沉淀物；(5)将步骤(4)得到的沉淀物冻干，即得乌司他丁。2.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，步骤(1)中所述的微波处理，处理温度为40-60℃；处理功率为200-350w；微波处理时间为每吨尿液5-10min。3.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，所述的层析柱选自亲和层析柱、离子交换柱、疏水柱、吸附柱、金属螯合柱和凝胶过滤层析柱中的一种或几种；优选地，上述层析柱为亲和层析柱、疏水柱和凝胶过滤层析柱。4.根据权利要求3所述的层析柱，其特征在于，所述离子交换柱可以选自QSepharoseH.P、QSepharoseF.F、QSepharose4F.F、QSepharoseXL、QAESephadexA-25、STREAMLINEQXL、DEAESepharoseF.F、DEAESepharoseA-25、DEAESepharoseA-50或STREAMLINEDEAE。5.根据权利要求3所述的层析柱，其特征在于，所述金属螯合柱的填料可以选自ChelatingSepharoseFastFlow、CoSepharoseFF、NiSepharoseFF和CuSepharoseFF中的一种。6.根据权利要求3所述的层析柱，其特征在于，所述亲和层析柱的填料可以选自CM-SephadexA-25、CM-SephadexA-50、CM-SephadexC-25、CM-SephadexC-50、SP-Sepharose2B、HiTraprProteinAFF、SP-Sepharose4B、SP-Sepharose6B、SP-SepharoseCL-2B、SP-SepharoseCL-4B、SP-SepharoseCL-6B或HiTraprProteinAHF中的一种；优选地，上述的亲和层析柱的填料可以选自HiTraprProteinAFF或/和ProteinASepharoseCL-4B。7.根据权利要求3所述的层析柱，其特征在于，所述疏水柱的填料可以选自：ButylSepharose4FastFlow、OctylSepharose4FastFlow、PhenylSepharose6FastFlow、Butyl-sSepharose6FastFlow、ButylSepharose4B或OctylSepharoseCL-4B中的一种；优选地，上述疏水柱的填料为PhenylSepharose6FastFlow。8.根据权利要求3所述的层析柱，其特征在于，所述凝胶过滤层析柱的填料可以选自Superdex30perpgrade、Superdex75perpgrade、Superdex200perpgrade、Superdex6perp