纯化的乌司他丁及其制备方法和含有该乌司他丁的药物组合物.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN109776674A(43)申请公布日2019.05.21(21)申请号201910123165.0(22)申请日2019.02.19(71)申请人广东天普生化医药股份有限公司地址510665广东省广州市天河区天河高唐科技产业园高普路89号申请人上海医药集团股份有限公司(72)发明人许文勤宋建东王玥柯樱李翰明(51)Int.Cl.C07K14/81(2006.01)C07K1/18(2006.01)C07K1/16(2006.01)C07K1/14(2006.01)A61K38/57(2006.01)权利要求书1页说明书10页(54)发明名称纯化的乌司他丁及其制备方法和含有该乌司他丁的药物组合物(57)摘要本发明提供一种乌司他丁及其制备方法，5万单位/ml的乌司他丁在405nm处的吸光度值不超过0.09，人尿激肽原酶的含量不超过0.00025PNAU，重金属含量不超过0.8μg/ml，细菌内毒素含量不超过3.0EU/ml。通过亚硝酸盐、硫酸铵、聚乙二醇、调节pH等方法对尿液进行预处理，同时在过柱前采用透析的方法进行初步的纯化，再依次通过凝胶柱和阳离子交换柱制备得到乌司他丁纯品，大大简化了制备工艺的同时保证成品的纯度和收率，药物活性有很大提升。CN109776674ACN109776674A权利要求书1/1页1.一种乌司他丁，其特征在于，所述乌司他丁浓度为5万单位/ml时，在405nm处的吸光度值不超过0.09，人尿激肽原酶的含量不超过0.00025PNAU，重金属含量不超过0.8μg/ml，细菌内毒素含量不超过3.0EU。2.根据权利要求1所述的乌司他丁，其特征在于，所述乌司他丁浓度为5万单位/ml时，在405nm处的吸光度值不超过0.08，人尿激肽原酶的含量不超过0.0002PNAU，重金属含量不超过0.5μg/ml，细菌内毒素含量不超过2.5EU。3.根据权利要求1所述的乌司他丁，其特征在于，所述乌司他丁采用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳测定的分子量为37,000-43,000Da或采用高效液相色谱法测定的分子量为62,000-72,000Da。4.一种权利要求1-3任一项所述乌司他丁的制备方法，包括以下步骤：(1)尿液中加入亚硝酸盐，调节pH，搅拌，硫酸铵溶液进行洗脱，洗脱液进行抽滤，保留滤饼；(2)滤饼加水溶解，调节pH，加入聚乙二醇，过滤，沉淀物干燥；(3)步骤(2)沉淀物加水溶解，透析，干燥，即得乌司他丁粗品；(4)乌司他丁粗品加水溶解，过凝胶柱层析，蒸馏水洗脱，收集组分，浓缩，干燥；(5)步骤(4)样品加水溶解，加入阳离子交换层析柱上样，用盐酸洗脱，收集洗脱液浓缩，冷冻干燥，即得乌司他丁纯品；其中，所述步骤(4)中凝胶柱层析填料为葡聚糖凝胶G-75，所述步骤(5)中阳离子交换柱为732型阳离子交换树脂。5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中尿液与亚硝酸盐的重量比为1吨：13-16kg。6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中硫酸铵溶液浓度为8-12％。7.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中滤饼加1-3倍水溶解，调节pH5.0-6.0，加入8-12倍聚乙二醇，搅拌20-40min，静置，板框过滤，沉淀物冷冻干燥。8.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(4)中洗脱速度为0.4-0.6ml/min。9.一种药物组合物，其含权利要求1-3任一项所述乌司他丁或权利要求4-8任一项所述制备方法制备得到的乌司他丁作为活性成分。2CN109776674A说明书1/10页纯化的乌司他丁及其制备方法和含有该乌司他丁的药物组合物技术领域[0001]本发明涉及一种生物技术领域，具体涉及纯化的乌司他丁及其制备方法和含有该乌司他丁的药物组合物。背景技术[0002]乌司他丁是从健康成年男性新鲜尿液中分离纯化出来的一种糖蛋白，由143个氨基酸组成，相对分子质量约67000。1909年，Beurer和Reich第一次报道了人尿液中存在这种胰蛋白酶抑制剂，对胰蛋白酶、α-糜蛋白酶等丝氨酸蛋白酶及粒细胞弹性蛋白酶、透明质酸酶、巯基酶、纤溶酶等多种酶有抑制作用。另具有稳定溶酶体膜，抑制溶酶体酶的释放，抑制心肌抑制因子(MDF)产生，清除氧自由基及抑制炎症介质释放的作用。乌司他丁还可改善手术刺激引起的免疫功能下降、蛋白代谢异常和肾功能降低，防止手术刺激引起的对内脏器官与细胞的损伤以及改善休克时的循环状态等。[0003]乌司他丁多样的生物功能与其独特的分子结构相关，乌司他丁主要由3个功能域构成，包括O连接糖基化区域(Alal-Lys21)、N端Kunitz型结构域I(Lys22-Arg77)和