酵母固态发酵具体实验方案(1).doc

酵母固态发酵实验方案
实验目的
1.学习酵母固态发酵实验步骤、条件。
2.掌握酵母发酵产物的分析方法（气质联用仪的使用）。
3.了解酵母固态发酵的过程以及产物特征。
4.学习自主设计实验的方法与步骤。
实验原理
1.酵母与发酵糟醅中微生物区系协同作用，产生复杂的代谢产物。
2.利用气质联用仪可对发酵产物进行成分与含量的分析。
实验材料、仪器与试剂
材料：酵母菌、酵母固态发酵酒醅、黄水等；
仪器：气质联用仪、灭菌锅、窖粮糟、锥形瓶、烧杯、接种针、接种环、移液枪等；
试剂：YPD培养基、糟醅浸汁液体培养基、蒸馏水等。
实验步骤
（一）、酵母活化
1.1将保存菌种的EP管取出，4℃冰箱中解冻2-3h。
1.2用牛皮纸包好130个平板（每个包12个）、4支接种针、130支10mL试管，并将1000mL蒸馏水（洗脱酵母用，130*5=650mL，实验时制备1000mL）分装至4个500mL锥形瓶中，塞好棉花塞后，用牛皮纸包好，121℃灭菌20min，灭菌完成后移至超净工作台冷却，备用。
1.3配制YPD培养基（130株菌，共计130*30mL=3900mL，实验时制备4000mL备用）
（1）称取40g酵母膏,80g蛋白胨于4000ml水中，加入80g琼脂粉于电磁炉专用锅（2个）中，加热搅拌溶解，用盐酸与氢氧化钠溶液调pH为4.5，分装至16个500mL锥形瓶中；
（2）塞好棉花塞后，用牛皮纸包好，121℃灭菌20min；
（3）灭菌完成后移至超净工作台冷却至50℃-60℃，制备平板共计130个。
1.4接种酵母，培养
（1）在超净工作台上，用接种针将EP管中的酵母挑取到制备好的平板上划线（每株菌一个平板）；
（2）贴好标签后，移至恒温培养箱中28℃培养至形成肉眼可见的单菌落。
1.5制备酵母菌悬液
（1）在超净工作台上，向平板中加入5mL先前制备好的无菌蒸馏水（条件允许时用酵母生理盐水），用接种针挑动，洗脱菌落，得酵母菌悬液；
（2）移至10mL试管中，塞好棉花塞后，贴好标签，备用。
、实验设备转移（实验室至生产现场）
1.准备约140个玻璃发酵坛（每株菌一个共130个，空白糟醅（未拌酒曲）一个、生产厂方发酵生产糟醅（加无菌水5%）一个、发酵完成但未蒸馏的糟醅一个、老师实验用2个、其它5个），装箱；
2.准备150双塑料手套、一张约10平方米塑料纸、150张保鲜膜、10个50mL烧杯（拌黄水与菌种用）、4支玻璃棒，2-4壶开水（在厂方接取）等；
3.将上述物品与制备好的酵母菌悬液（试管）一并用车带至生产厂方，备用。
、接种、拌和、封坛
1.将10平方米的塑料纸铺开，铲取130*700=91000mL约130*500=65000g=65kg（实验时可相应增加使用量）的糟醅（未拌酒曲）于塑料纸上；
2.分2-4组，拌和。每株菌用35mL黄水、700mL(500g)糟醅、5mL酵母菌悬液。
（1）用开水将烧杯与玻璃棒灭菌，冷却；
（2）移取700mL(500g)糟醅于一张保鲜膜上，将35mL黄水与5mL酵母菌悬液在烧杯中用玻璃棒拌匀后倒在糟醅上，带上手套拌和均匀（每株菌用一双手套、烧杯与玻璃棒拌菌后用开水灭菌，冷却）；
（3）将拌好菌的糟醅移至发酵坛中，压至理想程度后，盖上坛盖，用细沙封口，贴好标签。
（4）操作完成后带走垃圾并打扫好卫生。
（5）将发酵坛转车运回实验室30℃恒温培养30d（开空调调温），定期观察记录。
附：
酵母浸提液制备：从厂方带回65kg的糟醅用1:1的热水浸泡煮沸5min，沥取浸提液于塑料桶中（或在厂方将浸提液制备好后带回），冷冻备用
王老师实验用发酵材料：
1.700mL(500g)糟醅（拌曲）+半坛黄水
2.700mL(500g)糟醅（拌曲）+整坛黄水
3.具体操作参照酵母固态发酵实验方法。