酵母菌酒精发酵实验方案.docx

实验方案

酵母菌酒精发酵的条件研究

学院（部）：生物与化学工程学院
专业：生物工程
学生姓名：
学号：11018150
班级：生物工程二班
指导教师：肖连冬

实验目的
1、学会实验的设计和操作过程
2、找到酵母菌发酵时的最优条件
培养基和实验方法及材料的确定
玉米粉的糖化方法
玉米粉的糖化采用双酶法，其工艺流程如下
玉米粉→加水→液化→糖化→发酵→蒸馏→成品酒精
试验中，发酵培养按照三角瓶100ml培养。本次工做20组是要，共需发酵液20*100=2000ml。培养液按照100g玉米粉、300ml水。所以共需玉米粉700g。
液化：取１００ｇ玉米粉，加入３００ｍＬ的水，液化温度为９０℃，ｐＨ值为５．５，液化时间为３．５ｈ，液化酶的添加量为０．０３５ｇ／１００
ｇ玉米粉
糖化：糖化时的工艺条件为：糖化温度为５８℃，ｐＨ值为４．５，糖化时间为３．５ｈ，糖化酶的添加量为０．３ｇ／１００ｇ玉米粉。
活化培养基
本实验在进行实验时采用察氏(czapck)培养基的配制，配方如下表一：
蔗糖NaN03K2HP04KClMgSO4·7H2OFeS04琼脂蒸馏水pH3g0.3g0.1g0.05g0.05g0.001g1.5-2g100ml7表一
扩大培养基
扩大培养仍然用察氏(czapck)培养基，由于要用液体的，所以将其中的琼脂配料去掉。
发酵培养基
糖化液稀释至l0%浓度，添加辅料（硫酸铵0.4%），pH5.5灭菌
培养基的制备及酵母的活化
1、准备酵母母菌一支常温下存放一天，增加菌种的活力。在母菌存放期间制作各时期培养基
2、准备固体培养基（察氏培养基）50ml，做成8支试管斜面，扩大培养基800ml（做扩大培养时使用）。做成8个三角瓶，每瓶200ml。120℃灭菌30min。
3、发酵液的制备
（1）玉米粉的筛选
实验前准备粉碎后的玉米粉700g。
（2）玉米粉的液化
按照100g玉米粉、300ml水的配比对玉米粉进行液化，液化方案上文已经交代。在1000ml烧杯里，或者500ml烧杯分两次，水浴液化。
器材：烧杯500ml两个，玻璃棒一个，水浴锅一个，糖化酶0.225g
步骤：1、将糖化酶，玉米粉，水按照比例配置好在烧杯里。2、将配好的玉米液放于水浴锅中90℃液化3.5h。边液化边搅拌。
（3）玉米粉的糖化
将液化后的玉米液中按照0.3g/100ml加入液化液中。再在水浴锅中，58℃糖化3.5h。
（4）过滤
糖化后的糖化液有可能有没有彻底液化的玉米颗粒，会造成浑浊，这时需要对糖化液进行过滤操作。
操作步骤：
最后与以上培养基一起进行灭菌处理。灭菌时，清洗16支移液管，与培养基一起灭菌。
（5）活化步骤
器材：酒精灯，接种针，母菌，斜面培养基，消毒酒精。
步骤：1、将器材放于实验台上。对双手合桌面进行灭菌。对接种针进行灼烧灭菌。2、在酒精灯旁按照无菌操作步骤在酒精灯火焰旁取下试管棉塞。3、将灼烧后的接种针伸入母菌试管取粘取少量母菌，粘取前将接种针放于试管内壁，冷却5~6s。4、按照无菌操作将取过母钟的接种针移入活化试管内并画曲线。5在酒精灯火焰旁将试管棉塞塞上，塞前将棉塞烧一下。如此接种八支试管。并保存28℃培养2d。
酵母的扩大培养
器材：液体培养基，活化后菌种，酒精灯，接种针，消毒酒精。
步骤：1、将器材放于试验台上，并对双手和桌面灭菌，接种针进行灼烧灭菌。2、在酒精灯旁取下棉塞，并用接种针接种少量菌种于液体培养基内。3、在酒精灯旁塞好棉塞，并于28℃培养。根据发酵单因素的不同，确定培养时间。其中变量是菌龄的一瓶瓶号1、2要求培养时间分别为：对数期1：15~16h，对数期2:16~18h，缓冲期：20~24h，稳定期：24~26h。其他菌种培养20h进行接种。
五、发酵培养
不同菌龄下的发酵
器材：扩大菌种的四个不同阶段即对数期1：15~16h，对数期2:16~18h，缓冲期：20~24h，稳定期：24~26h。移液管四个，酒精灯，发酵液，洗耳球。
步骤：1、将对数期1的菌种和其他设备放于实验台上。2、用移液管按照发酵液的10%的比例移取扩大培养液到发酵液中。3、塞好棉塞将发酵液放于30℃条件下培养2d。4、按照以上步骤将不同菌龄的扩大菌种移接到发酵液中进行发酵培养。之后进行酒精检测。
不同菌量下的发酵
器材：扩大菌种，移液管四个，酒精灯，发酵液，洗耳球。
步骤：1、将实验器材放于实验台上。2、用移液管移取8%的扩大菌种到发酵液中。3、塞好棉塞，将发酵液存放于30℃条件下发酵2d。4、按照以上步骤，分别移取10%、12%、14%的扩大菌种到发酵液中，30℃培养2d，之后进行酒精检测。
不同醪液浓度下的发酵
器材：扩大菌种，移液管四个，酒精灯，发酵液，洗耳球。
步骤：1、将实验器材放于实