实时荧光定量PCR检测金黄色葡萄球菌方法的试验研究.doc

实时荧光定量PCR检测金黄色葡萄球菌方法的试验研究
【摘要】目的建立金黄色葡萄球菌实时荧光定量PCR的快速检测方法，探讨该方法的可行性和应用价值。方法根据金黄色葡萄球菌femB基因序列设计引物和探针，采用基因重组技术构建用于金黄色葡萄球菌检测的定量标准品，建立实时荧光定量PCR检测金黄色葡萄球菌的方法。结果成功构建了金黄色葡萄球菌重组质粒标准品和金黄色葡萄球菌实时荧光定量PCR方法；通过特异性、敏感性、稳定性和重复性试验，结果表明具有较好的特异性、敏感性、稳定性和重复性;将模拟标本与分离培养对比，两者符合率为100%。结论金黄色葡萄球菌实时荧光定量PCR检测方法的建立，为金黄色葡萄球菌感染诊断及食源性金黄色葡萄球菌污染的快速检测提供依据，可用于临床感染诊断及食品卫生监管、商品检验检疫等。
【关键词】葡萄球菌，金黄色;聚合酶链反应;葡萄球菌感染;诊断
金黄色葡萄球菌也是引起人类感染和食物中毒最常见的病原菌之一,对金黄色葡萄球菌的快速、准确检验是保证人类健康的必要手段。根据金黄色葡萄球菌femB基因序列设计特异性引物和探针，采用实时荧光定量PCR方法，建立金黄色葡萄球菌实时荧光定量PCR检测方法，为金黄色葡萄球菌的感染诊断以及食(乳)品中金黄色葡萄球菌的快速检测提供诊断依据。
材料与方法
1.试验菌株金黄色葡萄球菌(ATCC25923)购自中国菌种保藏中心;大肠杆菌、白色念珠菌、绿脓杆菌、伤寒沙门菌、福氏痢疾志贺菌、肠球菌为本科经临床分离鉴定后的保存菌株。
2.仪器及试剂所用仪器为ABI公司的PE7700型基因定量扩增仪和西安天隆科技有限公司的TL580型荧光定量PCR仪;主要试剂为PCRMix,Taq酶、dNTP，细菌基因组DNA抽提试剂盒均购自TaKaRa公司。
3.引物和探针的设计与合成根据金黄色葡萄球菌femB基因序列设计引物和探针。以FAM为报告基团，以TAMRA为淬灭基团，引物和探针由上海生化生物工程公司合成。其引物和探针序列分别为:上游引物:5'-AATTAACGAAATGGGCAGAAACA-3';下游引物:5'-TGCGCAACACCCTGAACTT-3';荧光标志探针序列:5'-FAM-AGAAATTAACTGGATGGTACGCGCGAAGA-TAMRA-3'。
4.方法1)金黄色葡萄球菌重组标准品的制备:①目的基因扩增，以金黄色葡萄球菌标准株为试验菌株提取模板DNA，应用所设计的引物对PCR扩增，产物经1.500琼脂糖凝胶电泳，获得目的基因扩增片段，产物回收纯化后测吸光度定量。②目的片段与载体的连接，在10川连接反应体系中，包括2XBuffer5pd-PGEM-T-easyvector1pI_,PCR产物2pI，T4DNA连接酶1pL，用无菌水补足至10川」，轻轻混匀，室温放置1h,4℃过夜连接。③重组质粒的转化，取上述连接产物1pI，加人100pL新鲜配制的E.coliJM109感受态细胞中，轻轻混匀，即冰浴30min,42℃热休克90s;即冰浴2min后，加人800[I预热的LB培养液中，以离心半径8cm220r/min37℃振摇1h。以离心半径8cm12000r/min离心5min，弃上清剩余约100pL菌液，混匀，用L型玻棒均匀涂布于含Amp-f-/IPTG/X-Gal的筛选平板，37℃培养过夜，同时设定未转化菌作为阴性对照。④重组质粒的鉴定，挑取经Amp/IPTG/X-Gal抗性筛选出的白色转化的菌落，于I_B培养液(含有Amp+)中进行小量增菌，以离心半径8cm220r/min37℃振摇过夜。对重组质粒进行PCR,T-A克隆阳性的菌落提取质粒，送宝生物公司进行测序。2)重组质粒标准品标准曲线的绘制:将鉴定好的重组质粒，测A值，计算出原始拷贝数，然后按比例稀释成10‘一10`'copy/mI浓度梯度，加人25pL反应体系，置实时荧光定量PCR扩增仪上进行扩增，反应条件为94、C预变性10min,95℃变性25s,60℃退火30s，进行40个循环。反应结束后，在计算机上自动形成标准曲线。3)荧光定量PCR检测体系的建立:在25μl反应体系中，PCRMasterMix(包括lOXPCR缓冲液、MgClz,dNTP,DNA聚合酶等)12.5pL,L、下游引物(10Icmol/I_)各0.5pI，探针(10ymol/I_)0.5I}L.I)NA模板0.5浏，用灭菌重蒸水补足25醉。实时荧光定量PC'R反应条件:94℃预变性10min,950C变性25s,60℃退火305，进行40个循环。4)金黄色葡萄球菌实时荧光定量PCR方法试验条件的验证:①特异性试验，分别以金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、白色念珠菌、绿脓杆菌、伤寒沙门菌、福氏痢疾志贺菌、肠球菌制备模板，用所建立的实时荧光定量PCR方法进行特异性