实时定量PCR简介.ppt

Real-timeQuantityPCR实时定量PCR简介实时定量PCR的两个重要概念作用原理SYBRGREEN
1.TaqMan探针方法的作用原理:
本方法的原理主要是利用Taq酶的5'→3'外切核酸酶活性并在PCR过程中反应体系加入一个荧光标记探针。TaqMan探针5'端标以荧光发射基团，3'端标以荧光猝灭基团。该探针在PCR过程中不能被延伸。当探针保持完整时，3'端猝灭基团抑制5'发射基团的荧光发射。在PCR的退火期。探针与引物所包含序列内的DNA模板发生特异性杂交。延伸期引物在Taq酶作用下延DNA模板延伸，当到达探针处，Taq酶发辉5'→3'外切核酸酶活性，继而发生置换。切断探针后，发射基团远离猝灭基团，荧光信号得到释放。这时荧光探测系统便会检测到光密度有所增加。模板每复制一次，就有一个探针被切断，并伴有一个荧光信号的释放。由于理论上被释放的荧光基团数目和PCR产物数量是一对一的关系，且光密度同释放的荧光基团的数目也成正比关系，因此该技术可对模板进行准确定量。由于扩增产物较短时效率较高，故扩增长度一般为50—150bp。探针设计一般应符合以下条件：
(1)GC碱基含量在40%-60%。
（2）避免单核苷酸序列的连续重复，尤其是G。
（3）避免5'端为G，因为G对荧光可能有抑制作用，尽量使C个数多于G。
（4）长度应在15--25个碱基左右，以保证结合的特异性。
（5）探针的Tm值要比引物的Tm值至少高出约10℃。
另外，探针与引物不能形成二聚体，位置与上游引物尽量接近但不要重叠。(2)SYBRGreenI荧光染料的作用原理(3)LUX™引物
图.LUX引物工作原理
Lux引物LUXTM技术的优势InvitrogenqPCR产品qPCR试剂盒(3)RNAUltraSenseOne-stepQuantitativeRT- PCRSystem适用于超低量RNA摸板的灵敏扩增的QRT-PCR系统
(4)PlatinumqRT-PCRThermoscriptOne-stepSystem
适用于扩增具有二级结构的RNA(2)适合于其他系统
①SuperscriptⅢPlatinumone-stepqRT-PCRKit
②SuperScriptⅢPlatinumSYBRGreenone-step qRT-PCRKit
(3)SuperscriptⅢPlatinumCellsDirect二步法
①SuperscriptⅢPlatinumCellsDirectTwo-step qRT-PCRKit
②SuperScriptⅢPlatinumCellsDirectTwo-step qRT-PCRKitw/SYBRGreen