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实时定量PCR（qRT-PCR）PolymeraseChainReaction（PCR）聚合酶链式反应KaryB.MullisPCR的基本原理50-65℃PCR的基本原理PCR基本原理
1、单、双链DNA，cDNA均可
2、不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制剂DNA结合蛋白类
3、一般100ngDNA模板/100L,模板浓度过高会导致反应的非特异性增加
1、引物浓度一般为0.1-0.5mol/L，浓度过高易导致模板与引物错配,反应特异性下降
2、引物的设计

（3）TaqDNA聚合酶（4）Mg2+1、dNTP浓度取决于扩增片段的长度
2、四种dNTP浓度应相等
3、浓度过高易产生错误碱基的掺入，浓度过低则降低反应产量
4、dNTP可与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度下降，影响DNA聚合酶的活性。变性使双链DNA解链为单链,94℃30-40s
退火
温度由引物长度和GC含量决定。
增加温度能减少引物与模板的非特异性结合;降低温度可增加反应的灵敏性。
循环参数常用PCR反应体系(以HiFiTaq为例)常用PCR反应条件几种常用PCR技术基因RT-PCR基本原理RT-PCR一般步骤2、反转录RT-PCR一般步骤反向PCR(reverse）PCR)已知序列cDNA末端快速扩增技术(RapidAmplificationofcDNAEnds,RACE)是一种基于PCR技术从低丰度的转录本中快速扩增cDNA的5'和3’末端的有效方法,以其简单、快速、廉价等优势而受到越来越多的重视。
AAAAAAAAmRNAqRT-PCR(QuantitativeRealTimePCR)1、SYBRGreen法SYBRGreen工作原理SYBRGreen法优缺点融解曲线（dissociationcurve）正常2、TaqMan探针法TaqMan法与SYBRGreenI的比较基线（Baseline）荧光阈值（threshold）Ct值（thresholdvalue）定量PCR的数学原理荧光定量PCR的解析方法相对定量内参基因内参基因的选择常用内参基因家蚕常用内参基因数据处理（ΔΔCt法）qRT-PCR的优点及限制因素 qRT-PCR限制因数更多关于qRT-PCR的信息，请参照：
引物设计引物设计