分析化学高效液相色谱HPLC.ppt

第8章高效液相色谱法HPLC
HighPerformanceLiquidChromatography§8.1高效液相色谱仪

四大部分组成：
溶剂输送系统（贮液器，高压泵）
进样系统（进样阀等）
分离系统（色谱柱等）
检测记录系统（检测器，记录仪等）1.高压输液泵

主要部件之一，压力：150～350×105Pa

为了获得高柱效而使用粒度很小的固定相（<10μm），液体的流动相高速通过时，将产生很高的压力，因此高压、高速是高效液相色谱的特点之一

应具有压力平稳、脉冲小、流量稳定可调、耐腐蚀等特性2.进样装置3.分离系统

包括色谱柱、恒温器和连接管等部件。
色谱柱一般用内部抛光的不锈钢制成。其内径为2~6mm，柱长为10~50cm，柱形多为直形，内部充满3～10mm高效微粒固定相。柱温一般为室温或接近室温

匀浆法填充柱：
将填料制成悬浮液，在高压泵的作用下压入装有洗脱
液的色谱柱。理论塔板数可达8万/米
4.检测器

要求:灵敏度高，噪音低，线形范围宽，响应快,
对温度和流速的变化不敏感
两种类型
溶质型检测器：
仅对被分离组分的物理或理化性质响应
如紫外，荧光，二极管阵列，电化学检测器
总体型检测器:
对试样和洗脱剂均有响应
如示差折光，介电常数检测器UV检测器最常用，占70％
池体积:1～10μL
光程常:2～10mm
波长:254nm
窗口:石英折光计由测量池和参比池组成（示差折光计）伏安计、安培计、库仑计和电导计等,首选安培计
可用于在工作电极的工作电压范围能还原或氧化的物质
电极表面易中毒5.梯度洗脱

分配比k相差很大的复杂混合物用一种溶剂很难完全分开

可采用两种或两种以上极性不同但可以相互溶解的溶剂，随时间按一定比例混合，连续改变洗脱剂的极性,离子强度或pH，以便改变被测组分的相对保留值，达到提高分离效果，缩短分析时间的目的梯度洗脱装置分为两类：
外梯度装置（又称低压梯度），流动相在常温常压下混合，用高压泵压至柱系统，仅需一台泵即可。
内梯度装置（又称高压梯度），将两种溶剂分别用泵增压后，按电器部件设置的程序，注入梯度混合室混合，再输至柱系统。
梯度洗脱的实质：通过不断地变化流动相的强度，调整混合样品中各组分的k值，使所有谱带都以最佳平均k值通过色谱柱。
它在LC中所起的作用相当于GC中的程序升温：
通过改变溶质的极性、pH值和离子强度来调节溶质的k值，在GC中借程序调节温度改变k值。§8.2几种常见的液相色谱形式1.液液色谱（分配色谱）

1941年Martin发明:用吸着在硅胶上的水作为
固定相，用氯仿为流动相
应用范围：最常用方法。
相对分子量小于3000，不带电的极性化合物
固定液的流失
样品一定要在两相中均能溶解才能分,分离，因而两相在某种程度上互溶
长时间使用将导致固定液流失，不利分离

防止固定液流失的方法
???防止固定液流失的方法

方法一:抑制柱

在分析柱之前，加一根与分析柱有相同固定液的预处理柱，在试样进样前，让流动相预先通过预处理柱，以便使流动相预先被固定液饱和，而使分析柱的固定液不受损失

缺点：麻烦
不能采用梯度洗脱技术
方法二:化学键合固定相
将固定液以Si-O-R键合在SiO2载体表面反相色谱
固定液为非极性
洗脱液为极性，如水（常用方法,75%)
C18柱（十八烷基化的SiO2填充柱）为标准色谱柱
应用：醇类、芳香族、蒽醌素、抗菌素、低聚物、甾族化合
物,维生素等极性不太大的组分2.液固色谱(吸附色谱)
分离原理
固定相为固体吸附剂，被分离组分在固定相上的吸附作用不同来进行分离的
固体相:极性的硅胶，Al2O3,MgSiO3等
硅胶柱的柱效高，容量大，最常见
流动相
“相似相用”:如极性大的组分选用极性强的洗脱剂，否则不易被洗脱。洗脱液的极性可用溶剂强度参数e表征，e越大，极性越强
应用
分离极性不同的化学物,同分异构体

不适用同系物的分离3.离子交换色谱

1975年H.Small发明,现为发展最快的分支
分离原理:离子交换树脂为固定相,试样中的离子与离子交换树脂上的离子发生离子交换反应K越大,溶质的离子与离子交换剂的相互作用愈大,保留值愈大
磺酸型阳离子交换树脂,阳离子的保留值大小:
一价阳离子：Cs+>Rb+>K+>NH4+>Na+>H+>Li+
二价阳离子：Ba2+>Pb2+>Sr2+>Ca2+>Cd2+>Cu2+>Zn2+>Mg2+
强碱性阴离子交换树脂,保留值大小顺序:
PO43->SO42->C2O42->I->HSO4->NO3->CN->NO2->Cl-
>HCOO->OH->F->CH3COO-
流动相
H2O、H2O+乙醇、H2O+pH缓冲剂
应用
无机离子,有机和生物酸碱。如氨基酸、核酸、蛋白质等4.尺寸排阻色谱法
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