高效液相色谱-HPLC.ppt

（一）高效液相基础知识（2017.03.29）色谱法原理与分类HPLC的组成HPLC的应用HPLC色谱图名词术语HPLC定量分析原理什么是色谱法色谱法溯源Tswett（茨维特)的实验色谱法原理色谱法的分类色谱法是一种现代的分离分析方法1906年正式命名(见诸文献)20世纪30年代开始广泛研究和应用高效液相色谱法的广泛应用始于20世纪70年代100多年前俄国植物学家Tswett(茨维特)分离植物色素时采用的实验方法他将植物色素的石油醚提取液倒入装有碳酸钙的直立玻璃管,再加入石油醚使其自由流下,结果色素中各组份互相分离形成各种不同颜色的谱带Tswett用希腊语chroma(色)和graphos(谱)描述他的实验方法，即现在的Chromatography(色谱法)一根长玻璃管填充碳酸钙的颗粒将碾碎之植物叶片的提取液灌入柱中随着石油醚提取液向下流过柱子，现出展宽的色带分离出不同的化合物Chromato--颜色Graphy--图象是利用混合物中各组份在不同的两相中溶解,分配,吸附等化学作用性能的差异,当两相作相对运动时,使各组分在两相中反复多次受到上述各作用力而达到相互分离两相中有一相是固定的,叫作固定相(StationaryPhase)有一相是流动的,称为流动相(MobilePhase),流动相又叫洗脱剂,溶剂相(Phase):物理化学术语,特指在某一系统中,具有相同成分及相同物理、化学性质的均匀物质部分。各相之间有明显可分的界面按流动相的物态分:气相色谱(GasChromatography,GC)用气体作为流动相(又叫载气)液相色谱(LiquidChromatography,LC)用液体作为流动相(又叫洗脱剂)按固定相的形态分:平面色谱o纸色谱o薄层色谱柱色谱高效液相色谱法–HPLC(HighPerformanceLiquidChromatography)–是一种区别于经典液相色谱,基于仪器方法的高效能分离手段:oHigh高oPerformance性能oLiquid液体的oPerformance色谱特点：高压、高效、高速、高灵敏度1.高效分离：n=105/米2.高速：使用高压泵，出峰时间几分钟到几十分钟3.高灵敏度：检测下限：10-9-10-13g（最小检测量）4.自动化程度高：仪器分析、电脑控制、色谱工作站5.应用范围广：可测有机物75%-80%适用：高沸点、热不稳定有机及生化试样的高效分离按流动相和固定相的相对极性分:正相色谱(NormalPhaseChromatography)o固定相的极性大于流动相反相色谱(ReversedPhaseChromatography)o固定相的极性小于流动相有机化合物的极性分子间作用力(静电引力,偶分子间作用力(静电引力,偶极力,色散力,氢键力)综合表现的一种表述按分离过程的机理分:1吸附色谱(AbsorptionChromatography)根据样品组分对活性固定相表面吸附亲和力的不同实现分离2分配色谱(PartitionChromatography)分离基于样品组分在固定相和流动相中的溶解度(分配系数)不同3离子交换色谱(IonExchangeChromatography)根据样品组份离子交换亲和力的差异分离,简称离子色谱(IC)4体积排除色谱(SizeExclusionChromatography)GPC(GelPermeationChromatography)•固定相是疏水性凝胶,流动相是有机溶剂GFC(GelFiltrationChromatography)•固定相是亲水性凝胶,流动相是水溶液由五大部分组成：：溶剂输送系统（贮液器，高压泵）进样系统（进样阀等）分离系统（色谱柱等）检测系统（检测器等）记录及数据处理系统2021/5/241.高压输液泵为了获得高柱效而使用粒度很小的固定相（<10μm），液体的流动相高速通过时，将产生很高的压力，因此高压、高速是高效液相色谱的特点之一应具有压力平稳、脉冲小、流量稳定可调、耐腐蚀等特性高压输液泵：恒压泵（流量随阻力变化重现性差）恒流泵（多用）：往复式注射式梯度洗脱装置作用：将两种或两种以上溶剂按一定程序连续改变配比，以改变流动相极性、离子强度、PH值、提高分离效率。低压梯度洗脱（常压混合，高压进柱，1个泵。）高压梯度洗脱（高压混合，高压进柱，2个泵。）安捷伦泵：小视频高效液相色谱仪流动相脱气的目的1、使色谱泵输液均匀准确，减小脉动。2、提高保留时间和色谱峰面积的重现性。3、防止气泡引起尖峰。4、使基线稳定，提高信噪比。5、降低溶剂的紫外吸收本底。6、减少死体积。7、防止填料氧化。视频：脱气目的在线脱气机2.进样装置3.分离系统包括色谱柱、恒温器和连接管等部件。色谱柱一般用内部抛光的不锈钢制成。其内径为2~6mm，柱长为10~50cm，柱形多为直