用于肝癌早期筛查的生物标志物组合、检测方法和试剂盒.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN113249487A(43)申请公布日2021.08.13(21)申请号202110730746.8(22)申请日2021.06.29(71)申请人北京求臻医学检验实验室有限公司地址100000北京市大兴区经济技术开发区经海四路156号院3号楼3层301(72)发明人段小红张怡然王冰杨春燕马宇王东亮(74)专利代理机构重庆百润洪知识产权代理有限公司50219代理人陈付玉(51)Int.Cl.C12Q1/6886(2018.01)C12Q1/6858(2018.01)C12N15/11(2006.01)权利要求书2页说明书11页序列表7页附图2页(54)发明名称用于肝癌早期筛查的生物标志物组合、检测方法和试剂盒(57)摘要本发明涉及分子生物技术领域，特别涉及用于肝癌早期筛查的生物标志物组合、检测方法和试剂盒，包括与乙肝阳性人群肝癌早期甲基化位点相关的8对靶标特异引物及对应的内参引物、特异性引物探针。与现有技术相比，本发明通过筛选中国乙肝阳性人群肝癌早期基因组超甲基化区域，并与白细胞基因组对应区域进行比对，选取8个可用于判别早期肝癌风险的引物及对应探针序列；利用甲基化敏感内切酶不能切割甲基化位点的特性，降解非肿瘤来源cfDNA，特异扩增肿瘤来源ctDNA极大提升检查灵敏度；不使用重亚硫酸盐转化，避免了cfDNA体外降解，检测灵敏度高，检测周期短、成本低、易于推广。CN113249487ACN113249487A权利要求书1/2页1.用于肝癌早期筛查的生物标志物组合，其特征在于：包括与乙肝阳性人群肝癌早期甲基化位点相关的8对靶标特异引物及对应的内参引物、特异性引物探针；其中所述8对靶标特异引物的序列如下：。2.根据权利要求1所述的用于肝癌早期筛查的生物标志物组合，其特征在于：所述内参引物的序列如下：。3.根据权利要求1所述的用于肝癌早期筛查的生物标志物组合，其特征在于：所述特异性引物探针和内参引物探针如下：。4.用于肝癌早期筛查的试剂盒，其特征在于：包括权利要求1‑3任一项所述的用于肝癌2CN113249487A权利要求书2/2页早期筛查的生物标志物组合。5.用于肝癌早期筛查的检查方法，其特征在于包括以下步骤：S1.提取血浆中的cfDNA；S2.将cfDNA与酶体系在37℃下孵育；S3.将孵育产物作为模板，加入8对靶标特异引物、内参引物，进行多重PCR扩增；S4.将扩增产物作为模板，加入8对靶标特异引物、8个特异性引物探针及内参引物，进行进行qPCR检测反应；S5.根据8对靶标特异引物与内参引物的Ct值之差ΔCt，评估肝癌风险。6.根据权利要求5所述的用于肝癌早期筛查的检查方法，其特征在于所述S1具体为：采用Qiagen血浆游离DNA提取试剂盒提取血浆中的cfDNA。7.根据权利要求5所述的用于肝癌早期筛查的检查方法，其特征在于所述S2中酶体系为含有HinP1I、HpaII、AciI、HpyCH4IV的甲基化敏感内切酶体系。8.根据权利要求5所述的用于肝癌早期筛查的检查方法，其特征在于所述S3的扩增程序为：98℃/45s，1cycles；（98℃/15s，55℃/30s，72℃/30s），8cycles；72℃/1min，1cycles；4℃/hold。9.根据权利要求5所述的用于肝癌早期筛查的检查方法，其特征在于所述S4的qPCR检测反应程序为：95℃/3min，1cycles；（98℃/15s，60℃/60s），40cycles。10.根据权利要求5所述的用于肝癌早期筛查的检查方法，其特征在于所述S5的评估方式为：ΔCt=8对引物特异扩增Ct值‑内参引物扩增Ct值；ΔCt>1肝癌高风险，建议定期超声检测；ΔCt≤1肝癌低风险。3CN113249487A说明书1/11页用于肝癌早期筛查的生物标志物组合、检测方法和试剂盒技术领域[0001]本发明涉及分子生物技术领域，特别涉及用于肝癌早期筛查的生物标志物组合、检测方法和试剂盒。背景技术[0002]癌症是中国死亡的首要原因，中国癌症死亡率高于发达国家，早期诊断率低是原因之一。早期诊断可以改善癌症预后，极大提升治疗成功率、降低成本、避免病情复杂化。肿瘤的早筛早诊早治疗对提高五年生存率具有非常大的意义。但是目前早期癌症受限于技术原因检出率低，肿瘤的早筛和早诊亟待有所突破。[0003]肝细胞肝癌(HepatocellularCarcinoma，HCC)是我国常见恶性肿瘤之一。由于肝癌起病隐匿，早期没有症状，且多数患者缺乏普查意识，往往出现症状才到医院就诊而被诊断为晚期肝癌，而晚期肝癌治疗效果很不理想，平均生存期一般只有3‑6个月。对于肝癌患者而言，如果早期发现和诊断肝癌，就更有可能接受根治性治疗(手术、消融等)，其