单增李斯特菌PFGE快速分子分型实验室标准操作程序.docx

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单增李斯特菌PFGE分型实验室标准操作程序
生物安全警示：目前李斯特菌感染剂量尚不确定，取决于宿主的易感性。高风险感染群体为孕妇、婴儿、免疫力低下病人和老人。所以，接触李斯特菌的实验人员必须意识到潜在的风险并且注意相关的建议。
Day0
受试培养物单菌落划线于脑心浸液平板，于37℃培养14-18h。建议利用螺口管保存菌种一支，并且用同一接种环划线平板。确保需要时可以对同一培养物进行试验。
Day1
开启水浴摇床（54-55℃）、水浴箱（55-60℃）和分光光度计。
准备TEbuffer（10mMTris:1mMEDTA，pH8.0），配方如下：
10ml1MTris，pH8.0，2mL0.5MEDTA，pH8.0，稀释于1000mL无菌超纯水（临床实验室试剂用水）。
注意：TEbuffer用于SeaKem琼脂糖胶栓制备、悬浮细胞和洗涤裂解的PFGE胶栓。
准备溶菌酶（sigmaL7651）母液（20mg/mL），配方如下：
称量100mg溶菌酶（器皿放置于冰上保持低温）
加入5mLTEbuffer，涡旋混合。
分装（250μL）于eppendorf管中，冷冻备用。
TEbuffer(10mMTris:1mMEDTA，pH8.0)制备1%SeaKem金琼脂糖+1%SDS，配方如下：
20%SDS储液置于55-60℃水浴箱预热；
称取0.25gSeaKem金琼脂糖，加入25mlTEbuffer，温和混匀，微波加热至完全溶解；
加入2.5ml10%SDS，混匀，置于55-60℃水浴箱中备用。
将培养物编号标记于Falcon2054管，吸取2mLTEbuffer于管中，用灭菌棉签或接种环刮去培养物，轻轻转动接种环（棉签）将培养物悬浮于TEbuffer中，尽量避免产生气泡。
注意：细胞悬浮液体积大小取决于细胞浊度测定仪的使用体积。
将细胞调至以下浓度：
分光光度计法：OD610nm=1.0（0.8-1.0）；
DadeMicroscan浊度仪：0.40-0.45（Falcon2054管测定）
0.58-0.63（Folcon2057管测定）
bioMerieuxVitek色度计:17-18%透过率（Falcon2054管测定）
注意：6a、6b、6c的细胞浓度值在CDC试验中得到满意的实验结果，如果利用不同的仪器或者试管，可以根据自己实验室优化细胞浓度已得到最优试验结果。
胶块制备
将培养物编号标记于PFGE胶栓进行胶块制备。
注意1：未用完琼脂糖可以保存于室温，重复利用1~2次。中低档微波10-15s，混匀，直到琼脂糖完全溶解。
注意2：蛋白酶K溶液（20mg/mL）可以商业购得，也可以利用无菌超纯水溶解蛋白酶K粉末制得。为了得到最好的实验结果，分装（300-500μL）储存于-20℃备用。使用前先冻融并放置冰上保持低温状态。如果蛋白酶K储液由粉末制得，丢弃剩余的蛋白酶K。
移取400μL细胞适当浓度的悬浮液至1.5mL离心管中。
加入20μL冻融的溶菌酶（20mg/mL）储液，温和混合。将离心管置于55-60℃水浴箱中水浴10-20min。丢弃剩余的溶菌酶。
加入20μL蛋白酶K（20mg/mL），用移液枪温和混匀。
加入400μL溶解的1%SeaKem金琼脂糖于400μL细胞悬浮液中，来回上下颠倒几次温和混匀。在55-60℃水浴箱中水浴使得金琼脂糖胶保持溶解状态。
迅速将琼脂糖胶注入胶栓中，避免产生气泡。每个样品制备两个胶栓胶块作为平行实验。室温下放置10-15min（4℃下5min）至金琼脂糖凝固。
注意：利用一次性胶栓模块制备胶块，200μL细胞悬浮液，10μL溶菌酶（20mg/mL）10μL蛋白酶K（20mg/mL），200μL金琼脂糖可以制备4块胶块。
注意：细胞悬浮液和胶块制备要在短时间内进行，防止细胞提前裂解。如果制备大批量的样品，推荐一次处理10个样品。当第一批样品处于细胞裂解温育阶段，即可进行下一批样品制备，直到样品制备完毕，增加裂解时间对细胞裂解效果影响不大。
细胞胶块内裂解
注意：同一菌株的两个胶块（重复利用胶栓制备）或者3-4块胶块（一次性胶栓制备）可以在同一50mL离心管中进行裂解。
将培养物编号标记于50mL螺口离心管中。
制备细胞裂解液（50mMTris:50mMEDTA,pH8.0+1%Sarcosyl），配方如下：
25mL1MTris,pH8.0
50mL0.5MEDTA,pH8.0
50mL10%sarcosyl(N-laurolsarcosine,Sodiumsalt)
稀释于500mL无菌超纯水中。
计算所需细胞裂解/蛋白酶K缓冲液体积：
每个50mL离心管需要5mL细胞裂解液（50mMTris:50mMEDTA,pH8.0+1%Sarcosyl