一种从人胎盘或脐带中提取间充质干细胞及提取其分泌物的方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN111172106A(43)申请公布日2020.05.19(21)申请号202010056742.1(22)申请日2020.01.16(71)申请人广州益养生物科技有限公司地址510005广东省广州市国际生物岛螺旋四路7号标准产业单元二期三栋七层申请人广州暨大美塑生物科技有限公司(72)发明人夏黎明王亮万阳(51)Int.Cl.C12N5/0775(2010.01)A61K8/99(2017.01)A61K8/98(2006.01)A61Q19/00(2006.01)权利要求书2页说明书5页(54)发明名称一种从人胎盘或脐带中提取间充质干细胞及提取其分泌物的方法(57)摘要本发明提供了一种从胎盘或脐带中提取间充质干细胞及提取其分泌物的方法。该方法可有效缩短间充质干细胞原代细胞培养时间，对组织块伤害小，可以稳定进行多次间充质干细胞原代培养，操作简便，实用性强，因此本发明在间充质干细胞原代细胞培养及其应用等方面具有广阔的应用前景。在此基础上，发明人还提供了一种纯化间充质干细胞的培养方法，可将细胞纯度提高到99％。本发明还公开了一种提取间充质干细胞分泌物的方法，建立了相关的质量控制与评价实验，使得间充质干细胞分泌物能有效地在化妆品、保健品等行业进行应用。本发明不仅适用于人和小鼠等间充质干细胞培养，同时也适用于骨髓或脂肪来源的干细胞、癌旁组织等细胞培养。CN111172106ACN111172106A权利要求书1/2页1.一种从人胎盘或脐带中提取间充质干细胞及提取其分泌物的方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤(1)：将胎盘或脐带装入无菌容器中，无菌容器内保存液必须浸没过胎盘或脐带，密封容器并在4℃条件下8小时内运送回实验室；步骤(2)：胎盘处理：使用已高压灭菌的手术剪去掉胎盘外膜，取内部暗红的组织块，使用含肝素钠的生理盐水洗净组织中的血液，最后使用生理盐水再清洗一遍；脐带处理：使用已高压灭菌的手术剪将脐带剪成约2cm/段，用含肝素钠的生理盐水洗净血液，纵向剪破脐带，去除3条血管及外皮，洗净内部的血液，将脐带组织切成3.0～5.0mm3小块，生理盐水洗净；步骤(3)：胎盘组织处理：胎盘组织使用混合酶消化法于37℃恒温水浴摇床中消化1-1.5h，消化完毕后，稀释过滤离心，选择性完全培养基重悬接种于相应数量的6孔板或一次性平皿中，放置培养箱中培养；脐带组织处理：加一滴选择性完全培养基润湿组织块，在37℃、5％CO2的培养箱中静置培养0.5-1h。然后，补加选择性完全培养基至没过组织块，放置培养箱中培养；步骤(4)：待细胞汇合度达85％～95％时，即进行消化传代，传代至P3～P5更换为分泌培养基进行培养，待细胞汇合度达85％～95％时收集分泌液，细胞做冻存和鉴定处理；步骤(5)：通过流式细胞仪进行细胞表面标记物鉴定；冻存前取少量细胞上清液进行无菌检测；步骤(6)：将上述分泌液通过超滤系统进行浓缩，再过滤除菌得到间充质干细胞分泌原液备用，后续可做冻干处理得到间充质干细胞分泌物冻干粉。2.根据权利要求1所述的胎盘或脐带，其特征在于，步骤(1)至(6)中所述的胎盘或脐带符合是健康产妇(病毒检测结果阴性、遗传病检查项目阴性等)，足月婴儿，剖腹产等条件的胎盘或脐带方能收集使用。3.根据权利要求1所述的胎盘或脐带来源间充质干细胞分离培养方法，其特征在于，步骤(1)至(7)中所述的组织块培养方法同时适用骨髓来源干细胞、脂肪来源干细胞、癌旁组织等原代细胞培养。4.根据权利要求1所述的从人胎盘或脐带中提取间充质干细胞及提取其分泌物的方法，其特征在于：步骤(2)所述的含肝素钠的生理盐水为500ml生理盐水加入2支肝素钠，12500IU/支；步骤(3)所述的混合酶消化法，混合酶为胰酶-EDTA和IV型胶原酶1∶1混合使用；步骤(3)所述的稀释过滤离心，稀释为添加3-5倍生理盐水稀释，过滤为100μm孔径筛过滤，离心为1600rpm、10min离心后去上清；步骤(3)-(4)所述的培养均是置于5％CO2、37℃、饱和湿度的培养箱中培养；步骤(5)所述的细胞表面标记物鉴定应具有CD29、CD44、CD73、CD90、CD105等表面标记表达呈阳性，而CD14、CD34、CD45及T或B淋巴细胞等表面标记表达均为阴性；步骤(5)所述的无菌检测至少应做硫乙醇酸盐流体培养基、胰酪大豆胨液体培养基、血平板等接种培养检测；步骤(6)所述的浓缩为采用截留分子量3KD的膜包进行超滤浓缩；步骤(6)所述的过滤除菌为使用0.22μm的滤器进行过滤；2CN111172106A权利要求书2/2页步骤(6)所述的分泌原液优先选择浓缩至步骤(4)得到的分泌液体积的1/10～1/15。5.权利要求1步骤(6)间充质干细