用于检测膀胱癌的组合物及其试剂盒和应用.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN113943799A(43)申请公布日2022.01.18(21)申请号202010688356.4(22)申请日2020.07.16(71)申请人广州达健生物科技有限公司地址510000广东省广州市黄埔区国际生物岛螺旋大道51号官洲生命科学创新中心A塔第25层02、03、04、05单元申请人安徽达健医学科技有限公司(72)发明人邵琦(74)专利代理机构广州独角熊知识产权代理事务所(特殊普通合伙)44580代理人张小黎(51)Int.Cl.C12Q1/6886(2018.01)C12Q1/6858(2018.01)C12N15/11(2006.01)权利要求书2页说明书13页序列表6页附图2页(54)发明名称用于检测膀胱癌的组合物及其试剂盒和应用(57)摘要本发明提供用于检测膀胱癌的组合物及其试剂盒和应用，通过采用亚硫酸氢盐修饰法对待测膀胱癌核酸样品进行亚硫酸氢盐转化，结合荧光定量PCR技术，综合分析文献研究结果、TCGA甲基化芯片数据库以及转录组测序表达谱，通过多重数据过滤分析，筛选膀胱癌高甲基化候选基因，针对膀胱癌高甲基化候选基因上的多个甲基化检测位点设计特异性的基因甲基化检测引物和探针，覆盖10个以上甲基化CpG位点，通过多重PCR扩增技术扩增经亚硫酸氢盐修饰的待测DNA样品，根据PCR扩增结果来确定待测样品中目标基因的甲基化情况，通过多种途径提高试剂盒的灵敏度与特异性，实现膀胱癌的早期筛查与诊断。CN113943799ACN113943799A权利要求书1/2页1.用于膀胱癌基因甲基化检测位点，其特征在于，所述的基因甲基化检测位点包括ECRG4、TMEFF2、TWIST1中的一种或多种。2.用于膀胱癌基因甲基化检测的PCR引物探针组合，其特征在于，包括以下1)-3)所示的核酸序列组合中的一种或或多种：1)ECRG4甲基化检测的PCR引物及探针，包括引物探针组合1、引物探针组合2、引物探针组合3中的一种或多种，其中所述引物探针组合1包括如SEQIDNO.1所示的上游引物、如SEQIDNO.2与SEQIDNO.3所示的下游引物、如SEQIDNO.4所示的荧光探针，所述引物探针组合2包括如SEQIDNO.5所示的上游引物、如SEQIDNO.6所示的下游引物、如SEQIDNO.7所示的荧光探针，所述引物探针组合3包括如SEQIDNO.8所示的上游引物、如SEQIDNO.9所示的下游引物、如SEQIDNO.10所示的荧光探针；2)TMEFF2甲基化检测的PCR引物及探针，包括引物探针组合4、引物探针组合5、引物探针组合6中的一种或多种，其中所述引物探针组合4包括如SEQIDNO.11所示的上游引物、如SEQIDNO.12所示的下游引物、如SEQIDNO.13所示的荧光探针，所述引物探针组合5包括如SEQIDNO.14所示的上游引物、如SEQIDNO.15与SEQIDNO.16所示的下游引物、如SEQIDNO.17所示的荧光探针，所述引物探针组合6包括如SEQIDNO.18所示的上游引物、如SEQIDNO.19所示的下游引物、如SEQIDNO.20所示的荧光探针。3)TWIST1甲基化检测的PCR引物及探针，包括引物探针组合7、引物探针组合8、引物探针组合9中的一种或多种，其中所述引物探针组合7包括如SEQIDNO.21所示的上游引物、如SEQIDNO.22所示的下游引物、如SEQIDNO.23所示的荧光探针，所述引物探针组合8包括如SEQIDNO.24所示的上游引物、如SEQIDNO.25所示的下游引物、如SEQIDNO.26所示的荧光探针，所述引物探针组合9包括如SEQIDNO.27与SEQIDNO.28所示的上游引物、如SEQIDNO.29所示的下游引物、如SEQIDNO.30所示的荧光探针。3.如权利要求2所述的用于膀胱癌基因甲基化检测的PCR引物探针组合，其特征在于，还包括括检测内参基因GAPDH的PCR引物及探针，所述引物包括如SEQIDNO.31所示的上游引物、如SEQIDNO.32所示的下游引物，所述探针包括如SEQIDNO.33所示的荧光探针。4.如权利要求2或权利要求3所述的用于膀胱癌基因甲基化检测的PCR引物探针组合，其特征在于，所述荧光探针的5’端包含有荧光报告基团，所述荧光报告基团包括FAM、HEX、NED、ROX、TET、JOE、TAMRA、CY3、CY5中的任意一种。5.如权利要求2或权利要求3所述的用于膀胱癌基因甲基化检测的PCR引物探针组合，其特征在于，所述荧光探针的3’端包含有荧光淬灭基团，所述荧光淬灭基团包括MGB、BHQ-1、BHQ-2、BHQ-3中的任意一种。6.一种膀胱癌基因甲基化检测试剂盒，其特征在于，所述试