用于核酸检测的组合、试剂盒及其应用.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN114250286A(43)申请公布日2022.03.29(21)申请号202011005717.7(22)申请日2020.09.23(71)申请人迈克生物股份有限公司地址611731四川省成都市高新区百川路16号(72)发明人赵雨航葛志琪(51)Int.Cl.C12Q1/6883(2018.01)C12Q1/6858(2018.01)C12N15/11(2006.01)权利要求书1页说明书18页序列表3页附图2页(54)发明名称用于核酸检测的组合、试剂盒及其应用(57)摘要本发明公开一种用于核酸检测的组合、试剂盒及其应用。利用本发明核酸检测组合，在PCR反应中，第一引物以及第三引物可特异性的扩增靶核酸序列，扩增后的产物会新增一段与第一引物的信号检测区互补的序列，供后续的第二引物进行配对识别。随后第二引物以及第三引物可以与对应的预扩增模板进行配对并扩增，进一步地，第二引物上的二级结构区被线性化或解折叠，使第一检测基团与第二检测基团之间的距离产生变化而产生可检测信号，从而检测到相应的模板。该组合设计简单、且使用该组合进行核酸变异性检测的信噪比高，可大大降低荧光本底信号，同时本发明涉及的核酸检测灵敏度高，特异性好，成本低并且准确性高。CN114250286ACN114250286A权利要求书1/1页1.用于核酸检测的组合，其特征在于：包括第一引物、第二引物和第三引物；其中，所述第一引物从5’端至3’端依次包括信号检测区和靶序列结合区，所述信号检测区不与靶序列互补配对，所述靶序列结合区部分或全部与靶序列上扩增区域的3’端碱基互补配对；所述第二引物从5’端至3’端依次包括二级结构区和检测结合区，所述第二引物上连接有第一检测基团和第二检测基团，当二级结构区线性化或解折叠时，第一检测基团与第二检测基团之间的距离发生变化，由于距离的变化而产生可检测信号；所述检测结合区的序列与第一引物上信号检测区的部分或全部序列相同；所述第三引物与靶序列上扩增区域的5’端碱基序列相同。2.根据权利要求1所述的用于核酸检测的组合，其特征在于：所述第二引物的二级结构区选自发夹、茎环结构、假结和三螺旋。3.根据权利要求2所述的用于核酸检测的组合，其特征在于：所述第二引物的二级结构区为茎环结构，所述茎环结构包括第一茎干区、环区和第二茎干区；所述第一茎干区与第二茎干区碱基互补；所述环区为核苷酸环结构或非核苷酸环结构；当环区为核苷酸环结构时，所述环区为3～25bp的碱基序列；当环区为非核苷酸环结构时，所述环区选自dSpacer、C3Spacer、C6Spacer、C9Spacer、C12Spacer、Spacer9、Spacer18中的一种。4.根据权利要求2所述的用于核酸检测的组合，其特征在于：所述第一检测基团连接在第二引物的第一茎干区时，所述第二检测基团连接在第二茎干区上、第二茎干区与检测结合区之间或检测结合区的非3’末端上；当所述第一检测基团和第二检测基团分别为荧光基团和猝灭基团时，所述荧光基团选自FAM、TET、JOE、HEX、TAMRA、ROX、Cy3、Cy5、Cy5.5中的一种，所述猝灭基团选自BHQ-1、BHQ-2、BHQ-3、TAMRA、DABYCL、QSY-7中的一种。5.根据权利要求1所述的用于核酸检测的组合，其特征在于：所述组合还包括第四引物，所述第四引物从5’端至3’端依次包括信号检测区和第二靶序列结合区，所述第四引物上的信号检测区与第一引物上的信号检测区相同；所述第二靶序列结合区与第一引物上的靶序列结合区不同，并且所述第二靶序列结合区部分或全部与第二靶序列上扩增区域的3’端碱基互补配对。6.核酸检测的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括权利要求1～5任意一项所定义的引物。7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于：所述第一引物的长度为30～70bp，所述靶序列结合区的Tm值为50～80℃；所述第二引物的长度为25～70bp，所述环区的长度为6～20bp，检测结合区的Tm值为50～80℃；所述第三引物的长度为15～40bp，Tm值为55～75℃。8.用于数字PCR检测的组合，其特征在于：包括第一引物SEQIDNO:1、第二引物SEQIDNO:2和第三引物SEQIDNO:4；优选地，所述组合还包括阻断引物SEQIDNO:3；更优选地，所述组合还包括第四引物SEQIDNO:8和/或第五引物SEQIDNO:9。9.基于数字PCR检测的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括权利要求8所述的组合、dNTP和DNA聚合酶。10.权利要求1～5任意一项所述的组合在制备用于检测EGFR基因19外显子缺失突变的检测试剂盒的应用。2CN114250286A说明书1/18页用于核酸检测的组合、试剂