一种Nf1基因敲除动物模型的构建方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN113957096A(43)申请公布日2022.01.21(21)申请号202111247510.5(22)申请日2021.10.26(71)申请人上海交通大学医学院附属第九人民医院地址200011上海市黄浦区制造局路639号(72)发明人王智超李青峰魏澄江王薇顾熠辉(74)专利代理机构上海翼胜专利商标事务所(普通合伙)31218代理人翟羽(51)Int.Cl.C12N15/85(2006.01)C12N15/12(2006.01)A01K67/027(2006.01)权利要求书1页说明书7页序列表3页附图6页(54)发明名称一种Nf1基因敲除动物模型的构建方法(57)摘要本申请公开了一种Nf1基因敲除动物模型的构建方法，设计识别Nf1基因的gRNA；进行体外转录，获得Cas9mRNA和gRNA；构建同源重组载体；将Cas9mRNA、gRNA和同源重组载体显微注射到动物的受精卵中，获得F0代动物；将阳性F0代动物与野生型动物交配，获得F1代动物，即为Nf1基因敲除动物模型。该动物模型是国内首个成功成瘤的I型神经纤维瘤转基因动物模型，为I型神经纤维瘤发生发展机制的研究以及靶向治疗的等治疗方案探索提供稳定可靠的体内模型平台，弥补了目前相关模型缺乏的不足。CN113957096ACN113957096A权利要求书1/1页1.一种Nf1基因敲除动物模型的构建方法，其特征在于，包括：设计识别Nf1基因的gRNA；进行体外转录，获得Cas9mRNA和gRNA；构建同源重组载体；将所述Cas9mRNA、所述gRNA和所述同源重组载体显微注射到动物的受精卵中，获得F0代动物；将阳性F0代动物与野生型动物交配，获得F1代动物。2.根据权利要求1所述的Nf1基因敲除动物模型的构建方法，其特征在于，用于制备所述gRNA的引物序列如SEQIDNO.1至SEQIDNO.3所示。3.根据权利要求1所述的Nf1基因敲除动物模型的构建方法，其特征在于，所述同源重组载体包含5’同源臂、flox区域和3’同源臂。4.根据权利要求3所述的Nf1基因敲除动物模型的构建方法，其特征在于，所述同源重组载体的构建方法包括：用Infusion方法将所述5’同源臂、所述flox区域和所述3’同源臂的目的片段连接到pBR‑322载体上。5.根据权利要求4所述的Nf1基因敲除动物模型的构建方法，其特征在于，用如SEQIDNO.8和SEQIDNO.9所示的序列作为引物，以野生型动物基因组作为模板，PCR扩增获得所述5’同源臂的目的片段；和/或，用如SEQIDNO.10和SEQIDNO.11所示的序列作为引物，以野生型动物基因组作为模板，PCR扩增获得所述flox区域的目的片段；和/或，用如SEQIDNO.12和SEQIDNO.13所示的序列作为引物，以野生型动物基因组作为模板，PCR扩增获得所述3’同源臂的目的片段。6.根据权利要求1所述的Nf1基因敲除动物模型的构建方法，其特征在于，在F0代动物与野生型动物交配前，对所述F0代动物进行PCR鉴定，得到所述阳性F0代动物。7.根据权利要求6所述的Nf1基因敲除动物模型的构建方法，其特征在于，所述PCR鉴定所需PCR引物序列如SEQIDNO.4至SEQIDNO.7所示。8.根据权利要求1所述的Nf1基因敲除动物模型的构建方法，其特征在于，所述构建方法还包括：将所述F1代动物与具有施万细胞特异性Cre表达的动物交配，获得Nf1基因敲除动物模型。9.根据权利要求1所述的Nf1基因敲除动物模型的构建方法，其特征在于，所述动物为小鼠。10.根据权利要求9所述的Nf1基因敲除动物模型的构建方法，其特征在于，所述小鼠为C57BL/6J小鼠。2CN113957096A说明书1/7页一种Nf1基因敲除动物模型的构建方法技术领域[0001]本申请涉及基因编辑技术领域，具体涉及一种Nf1基因敲除动物模型的构建方法。背景技术[0002]I型神经纤维瘤病(NeurofibromatosisType1,NF1)是由于Nf1基因突变所导致的常染色体显性遗传病，是整复外科最常见的皮肤软组织肿瘤性疾病之一，发病率约为1：3500。Nf1突变或缺失导致神经纤维蛋白失活，活化的Ras不能水解转化为非活化的Ras，RAS通路持续异常激活导致细胞异常增生的病变。患者以Schwann细胞异常增殖的良性神经纤维瘤包括皮肤型神经纤维瘤和丛状神经纤维瘤纤维瘤为主要表现。[0003]因Nf1突变始于受精卵期，病变可累及皮肤、骨骼、血管、神经等多个系统，临床表现多样，但神经纤维瘤是NF1患者的特征性表型和主要就医诉求。神经纤维瘤虽为良性肿瘤，仍可造成周围组织破坏，引起患者容貌畸形、剧烈疼痛和功能障碍，对患者身