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(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN114058685A(43)申请公布日2022.02.18(21)申请号202010782390.8(22)申请日2020.08.06(71)申请人北京阅微基因技术股份有限公司地址100044北京市海淀区三里河路39号10号楼6层601室(72)发明人陈莹张奇张颖张晔(74)专利代理机构北京兆君联合知识产权代理事务所(普通合伙)11333代理人胡敬红(51)Int.Cl.C12Q1/686(2018.01)C12N15/11(2006.01)权利要求书4页说明书11页序列表3页附图4页(54)发明名称PCR检测中的消化探针及其试剂盒(57)摘要本发明涉及PCR检测中的消化探针及其试剂盒。消化探针,其结构为:探针5’端‑‑探针中部‑‑探针3’端,本发明通过调整消化探针结构和引入碱基修饰,使得消化探针5’端结合能力较弱,3’端结合能力较强,从而在保证对消化目的片段消化效率的前提下,强化消化特异性,使得目的片段对应检测信号得到更有效的富集,最终实现大幅提升检测灵敏度,可以实现液体活检。CN114058685ACN114058685A权利要求书1/4页1.一种用于降低样本中野生型DNA含量,提高突变型DNA丰度的消化探针设计方法,其特征是:针对于每个待检位点设置一组两条探针,分别对应待检位点的正链和负链;探针与待检测位点野生型DNA序列完全一致或互补,与突变型DNA序列不完全一致;探针3’部分与待检位点DNA结合能力较强,5’端与待检位点DNA结合能力相对较弱;其中不同位点对应的消化探针与对应野生型目的片段结合应有相同或相近的Tm值;所述消化探针与野生型目的片段结合的Tm值设置高于消化探针与突变型DNA结合的Tm值,同时不同消化探针之间结合成双链的Tm值要足够低。2.根据权利要求1所述的设计方法,所述探针的3’部分带有提高双链DNA稳定性的修饰。3.根据权利要求1-2任一所述的设计方法设计得到的微卫星不稳定状态检测中的消化探针,其结构为:探针5’端-探针中部-探针3’端,所述的探针5’端,为与对应位点对应目的片段单碱基重复序列3’端相邻序列的互补碱基,长度0至3个碱基;所述的探针中部,为与对应位点对应目的片段单碱基重复序列的互补碱基,碱基数量与对应位点野生型目的片段单碱基重复序列的重复数相同,或少一至两个碱基;所述的探针3’端,为与对应位点对应目的片段单碱基重复序列5’端相邻序列的互补碱基,长度4至10个碱基。4.根据权利要求1所述的消化探针,其中探针5’端,为与对应位点对应目的片段单碱基重复序列3’端相邻序列的互补碱基,长度0-2个碱基;探针3’端,为与对应位点对应目的片段单碱基重复序列5’端相邻序列的互补碱基,长度4-6个碱基,所述探针3’端区域碱基添加有修饰,或以修饰碱基取代正常碱基,所述修饰包括MGB修饰、荧光基团修饰、锁核酸修饰、肽核酸修饰、磷酸化修饰、硫代磷酸化修饰、空间子修饰。5.根据权利要求3所述的消化探针,所述修饰基团为LNA修饰。6.根据权利要求5所述的消化探针,所述微卫星不稳定状态检测为以下6个单核苷酸重复位点中的一个或多个:NR21、NR24、BAT25、BAT26、NR27和MONO27。7.根据权利要求5所述的消化探针,所述消化探针的序列为下表中的一对或多对探针序列示:2CN114058685A权利要求书2/4页其中探针序列中的+为LNA修饰。8.根据权利要求5所述的消化探针,所述消化探针的序列改动1-3个碱基,或者其3’端末端进行改动;所述改动包括替换、增加或删除一个或更多个碱基,同时保留其与目的片段特异性结合的能力。9.一种PCR检测试剂盒,含有权利要求1-6任一所述的消化探针,和扩增目的片段的引物组合物。10.根据权利要求9所述的检测试剂盒,所述目的片段为微卫星不稳定状态检测的6个单核苷酸重复位点:NR21、NR24、BAT25、BAT26、NR27、MONO27和3个对照位点;所述消化探针的序列如下表如示:3CN114058685A权利要求书3/4页其中探针序列中的+为LNA修饰;所述引物组合物为:NR-21引物:正向引物:5’-GAGTCGCTGGCACAGTTCTA-3’,反向引物:5’-FAM-ATATTCCTACTCCGCATTCACAC-3’,NR-24引物:正向引物:5’-TTGCTGAATTTTACCTCCTGAC-3’,反向引物:5’-TAMAR-ATTGTGCCATTGCATTCCAA-3’,NR-27引物:正向引物:5’-GGAAACAAAGCATTGAAGTCTGCAGT-3’,反向引物:5’-HEX-GAGGTTCTGAGTCGATAATACTAGC-3’,BAT-25引物:正向引物:5’-CTCG