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(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN113621053A(43)申请公布日2021.11.09(21)申请号202111004165.2A61K8/65(2006.01)(22)申请日2021.08.30A61L27/24(2006.01)A61Q19/00(2006.01)(71)申请人江苏亨瑞生物医药科技有限公司C12R1/19(2006.01)地址225500江苏省泰州市医药高新区药城大道六期标准厂房(人才公寓东侧)22幢一二层(72)发明人郭伟(74)专利代理机构北京哌智科创知识产权代理事务所(普通合伙)11745代理人陈培生(51)Int.Cl.C07K14/78(2006.01)C12N15/12(2006.01)C12N15/70(2006.01)C12N1/21(2006.01)权利要求书1页说明书5页序列表2页附图3页(54)发明名称一种重组人源胶原蛋白及其制备方法和应用(57)摘要本发明公开了一种重组人源胶原蛋白及其制备方法和应用,属于生物工程领域,该制备方法包括如下步骤:(1)获得重组载体:选取人类三型胶原保守区域肽段,将该序列重复8次进行人工全基因合成RHIIIC8,将其构建到pET22b的表达载体中获得重组载体;(2)构建重组基因工程菌:提取质粒、将其转化到BL21‑DE3‑PLySs感受态细胞中,挑取单克隆并对其扩大培养,获得重组基因工程菌;(3)制备重组人源胶原蛋白:经过诱导表达目的蛋白,然后对表达产物进行分离纯化,得到高纯度的可溶于水的重组人源胶原蛋白。本发明提供的重组人源胶原蛋白具有活性高的特点,可以广泛应用于生物医药和化妆品行业。CN113621053ACN113621053A权利要求书1/1页1.一种重组人源胶原蛋白,其特征在于,该重组人源胶原蛋白的编码基因RHIIIC8,RHIIIC8的核苷酸序列为SEQIDNO.1;RHIIIC8的氨基酸序列为SEQIDNO.2。2.含有权利要求1所述编码基因的表达载体。3.含有权利要求1所述编码基因的基因工程菌。4.一种如权利要求1所述的重组人源胶原蛋白的制备方法,其特征在于,所述方法包括如下步骤:(1)获得重组载体:选取人类三型胶原保守区域肽段,将该序列重复8次进行人工全基因合成RHIIIC8,将其构建到pET22b的表达载体中获得重组载体;(2)构建重组基因工程菌:提取质粒、将其转化到BL21‑DE3‑PLySs感受态细胞中,挑取单克隆并对其扩大培养,获得重组基因工程菌;(3)制备重组人源胶原蛋白:经过诱导表达目的蛋白,然后对表达产物进行分离纯化,得到高纯度的可溶于水的重组人源胶原蛋白。5.根据权利要求2所述的一种重组人源胶原蛋白的制备方法,其特征在于,步骤(3)中分离纯化的具体步骤如下:(3.1)将步骤(2)中的工程菌接种至LB培养基中,37℃培养过夜,按照体积比1:100转接LB培养基,在摇瓶中37℃培养至OD600为0.6,加入终浓度为0.1mM的IPTG,25℃培养6‑8小时,离心力为5000xg离心5分钟,收集菌体沉淀;(3.2)用PBS缓冲液洗涤菌体沉淀后重悬菌体沉淀,选择性加入终浓度1‑5mg/ml溶菌酶的TritonX‑100溶液帮助裂解细胞,在冰浴下超声破菌,12000rpm离心20min,收集上清液;所述溶菌酶的TritonX‑100溶液加入量以重悬所用PBS缓冲液体积为10ml/40ml;(3.3)用PBS缓冲液清洗镍离子亲和柱,然后将亲和柱和上清液分别在室温或冰上轻摇30min,上柱,用含有15mM咪唑的PBS溶液洗涤杂蛋白,优选洗脱1柱体积,洗涤至柱上仅剩下了纯RHIIIC8蛋白,在柱上加入PrescissionProtease蛋白酶,即PPase,于室温或冰上轻摇2小时,将RHIIIC8蛋白从柱上释放出来,用PBS溶液洗脱,优选1/2柱体积,收集洗脱液,所得产物透析过夜,冻干,获得纯化的重组人源胶原蛋白;其中,所述蛋白酶加入量以柱子体积计为1μL/5mL。6.根据权利要求5所述的一种重组人源胶原蛋白的制备方法,其特征在于,步骤(3.1)中LB培养基液体的组成为:胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、NaCl5g/L,溶剂为去离子水,pH值为7.5,在LB培养基液体中添加15g/L琼脂混匀后得到LB培养基平板。7.根据权利要求5所述的一种重组人源胶原蛋白的制备方法,其特征在于,步骤(3.2)中的超声破菌条件为:280W、2s超声,5s间歇,保护温度25℃,破菌时长为15min。8.根据权利要求5所述的一种重组人源胶原蛋白的制备方法,其特征在于,步骤(3.3)中冻干的具体步骤为:每5mg蛋白依次加入体积浓度为10%,5%,3%,2%,1%的甘露醇水溶液0.5ml,每个浓度在‑40