一种多重核酸检测系统及其制备方法与应用.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN114134219A(43)申请公布日2022.03.04(21)申请号202111537083.4C12N15/11(2006.01)(22)申请日2021.12.14(71)申请人广州市金圻睿生物科技有限责任公司地址510300广东省广州市黄埔区螺旋四路9号第四层B401单元、第五层B501单元、第六层B601单元(72)发明人陈嘉昌李楚明刘向东唐海辉王维世王辉芳张源明张乾毅胡朝晖柳俊(74)专利代理机构广州广典知识产权代理事务所(普通合伙)44365代理人曾银凤(51)Int.Cl.C12Q1/686(2018.01)权利要求书2页说明书24页序列表10页附图6页(54)发明名称一种多重核酸检测系统及其制备方法与应用(57)摘要本发明涉及一种多重核酸检测系统，其包括针对目标核酸序列的扩增引物组和检测探针组，该检测系统包括采用LNA修饰的Target探针和通过1～8个连续的G碱基达到荧光淬灭效果的Beacon探针，同时基于上述多重核酸检测系统的提出，发明人结合降落PCR程序，还提出了一种多重核酸检测方法，该方法能够进一步地减少PCR反应中非特异性扩增，提高检测灵敏度。从而克服传统实时荧光定量PCR分型局限性，通过特殊信号和熔解曲线分析实现单管多重分型，实现以更简便的反应体系、更低的检测成本来对样品中的至多20种待测目标核酸序列中的每一个靶基因，均可实现准确定性检测。CN114134219ACN114134219A权利要求书1/2页1.一种多重核酸检测系统，其特征在于，包括针对目标核酸序列的扩增引物组和检测探针组，所述检测探针组包括Target探针和Beacon探针，所述Target探针从5′端到3′端的组成依次为：5′端区、Target区、3′端区；所述Beacon探针从5′端到3′端的组成依次为：5′端区、loop区、3′端区；所述Target探针5′端区序列的5′端修饰LNA，所述3′端区序列的3′端修饰C3，所述Target区序列可与目标核酸序列反向互补；所述Beacon探针5′端区序列的5′末端为n个连续的鸟嘌呤，n为1‑8的整数，所述3′端区序列的3′末端修饰荧光报告基团，所述loop区序列与5′端区序列反向互补。2.根据权利要求1所述多重核酸检测系统，其特征在于，所述Target探针的3′端区序列的3′端为CGCG。3.根据权利要求1所述多重核酸检测系统，其特征在于，所述Beacon探针的5′端区序列长度为5～8bp，所述3′端区序列长度为5～8bp，和/或所述loop区序列长度为30～50bp。4.根据权利要求1‑3任一项所述多重核酸检测系统，其特征在于，所述Beacon探针的5″端区序列的5′末端连续的鸟嘌呤个数n为3～5的整数。5.根据权利要求1‑4任一项所述多重核酸检测系统，其特征在于，所述扩增引物组包括CLO引物对，所述CLO引物对中的每一条CLO引物从5′端到3′端的组成依次为：5′端区、loop区、3′端区；所述5′端区序列长度为18～25bp，所述3′端区序列长度为10～15bp，和/或所述loop区序列长度为15～25bp。6.根据权利要求5所述多重核酸检测系统，其特征在于，所述扩增引物组还包括通用引物对，所述通用引物对中的上游通用引物与CLO引物对中上游CLO引物的loop区一致；所述通用引物对中的下游通用引物与CLO引物对中下游CLO引物的loop区一致。7.根据权利要求1‑6任一项所述多重核酸检测系统，其特征在于，所述Beacon探针的3′端区序列的3′末端修饰荧光报告基团选自FAM、TET、JOE、HEX、Cy3、TAMRA、ROX、Texas、Red、LCRED640、Cy5、LCRED705、AlexaFluor488和AlexaFluor750。8.一种多重核酸检测方法，其特征在于，包括如下步骤：获取待测生物样本核酸；将上述生物样本核酸、DNA聚合酶与权利要求1‑7任一项所述多重核酸检测系统混合配制成PCR反应体系，进行PCR反应和熔解曲线分析。9.根据权利要求8所述多重核酸检测方法，其特征在于，所述PCR反应的反应程序为降落PCR。10.根据权利要求8‑9任一项所述多重核酸检测方法，其特征在于，所述PCR反应体系中，针对不同目标核酸序列的各条CLO引物浓度相同，每条通用引物的浓度也相同，且每条通用引物终浓度为CLO单条引物终浓度的5～15倍，进一步优选为10倍。11.根据权利要求8‑9任一项所述多重核酸检测方法，其特征在于，所述PCR反应体系中，针对不同目标核酸序列的各条Target探针的浓度相同，各条Beacon探针浓度相同，每条Target探针终浓度为Beacon探针终浓度的1～5倍，进一步优选为