鄞红葡萄PEPCK基因敲除载体的构建方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN114196698A(43)申请公布日2022.03.18(21)申请号202111422032.7A01H5/00(2018.01)(22)申请日2021.11.26A01H6/88(2018.01)(71)申请人浙江万里学院地址315100浙江省宁波市鄞州区钱湖南路8号(72)发明人肖旭腾吴月燕贾永红(74)专利代理机构宁波奥圣专利代理有限公司33226代理人谢潇(51)Int.Cl.C12N15/82(2006.01)C12N15/113(2010.01)C12N15/55(2006.01)C12N15/66(2006.01)C12N15/65(2006.01)权利要求书1页说明书3页附图4页(54)发明名称鄞红葡萄PEPCK基因敲除载体的构建方法(57)摘要本发明公开了一种鄞红葡萄PEPCK基因敲除载体的构建方法，根据原始载体pAtU6‑26‑sgRNA‑35S‑EGFP‑Cas9序列和CRISPR‑Cas9基因编辑技术的设计原则设计插入位点，将目的片段插入原始载体的AtU6‑26启动子和gRNAscaffold之间，实现pAtU6‑26‑sgRNA‑35S‑EGFP‑Cas9‑PEPCK基因敲除载体的构建。本发明是一种基于CRISPR‑Cas9基因编辑技术的糖异生关键基因PEPCK敲除载体的构建方法，通过内源性的基因调控，能够通过反向遗传技术在鄞红葡萄的基础上进一步研究和培育不同风味的新品种提供技术支持，具有较高的应用价值。CN114196698ACN114196698A权利要求书1/1页1.鄞红葡萄PEPCK基因敲除载体的构建方法，其特征在于，根据原始载体pAtU6‑26‑sgRNA‑35S‑EGFP‑Cas9序列和CRISPR‑Cas9基因编辑技术的设计原则设计插入位点，将目的片段插入原始载体的AtU6‑26启动子和gRNAscaffold之间，实现pAtU6‑26‑sgRNA‑35S‑EGFP‑Cas9‑PEPCK基因敲除载体的构建。2.根据权利要求1所述的鄞红葡萄PEPCK基因敲除载体的构建方法，其特征在于，具体包括以下步骤：S1、线性化pAtU6‑26‑sgRNA‑35S‑EGFP‑Cas9载体的制备对原始环形质粒载体pAtU6‑26‑sgRNA‑35S‑EGFP‑Cas9的AtU6‑26启动子和gRNAscaffold之间的两个BsaI酶切位点，利用FastDigestEco31I限制性内切酶完成对环形质粒载体的线性化，得到线性化载体；S2、sgRNA表达框的获得S2.1、根据CRISPR‑Cas9sgRNA设计原则，在鄞红葡萄PEPCK基因的第二外显子上，以TGG作为PAM位点，以PAM序列前的20nt的序列设计引物，并分别在设计的引物的5’端增加BsaI酶切位点碱基ATTG和AAAC，设计得到PEPCK‑F和PEPCK‑R两条引物，其序列分别为：PEPCK‑F：ATTGCCGACCCACACCTGAAGAGC；PEPCK‑R：AAACGCTCTTCAGGTGTGGGTCGG；S2.2、利用金属浴对PEPCK‑F和PEPCK‑R两条引物完成退火，形成sgRNA表达框；S3、pAtU6‑26‑sgRNA‑35S‑EGFP‑Cas9‑PEPCK基因敲除载体的获得将sgRNA表达框和线性化载体用T4连接酶进行连接，得到连接产物，再将连接产物转入大肠杆菌DH5α感受态细胞，培养后挑取白色单菌落进行菌液PCR，经琼脂糖凝胶电泳筛选阳性克隆后测序，获得的目标载体即为pAtU6‑26‑sgRNA‑35S‑EGFP‑Cas9‑PEPCK基因敲除载体，其中菌液PCR和测序所用引物均为P1和P2，其序列分别为：P1：TTGTATCTTGTTTCATAGTTTG；P2：TTTTAGGTTTCAGTTACAGA。2CN114196698A说明书1/3页鄞红葡萄PEPCK基因敲除载体的构建方法技术领域[0001]本发明涉及生物技术领域，具体是一种鄞红葡萄PEPCK基因敲除载体的构建方法。背景技术[0002]葡萄(VitisviniferaL.)是世界最古老的果树树种之一，也是我国的主栽水果之一，种植面积及产量均居世界前列。由于其良好的经济效益，在浙江省宁波市“鄞红”葡萄已被广泛栽培，具有丰富的营养价值、鲜甜独特的口感，广受人们的喜爱。随着市场经济的发展和消费者需求的提升，无论是鲜食葡萄还是酿酒葡萄，葡萄的品质直接影响了其经济价值。果实风味是影响葡萄品质的主要因素之一，受到果实内糖酸含量的影响，为了加大市场竞争力，实现“鄞红”葡萄糖酸含量和比例的调控是一重要手段。现有的葡萄糖酸含量和比例的调控以外源性的调控为主，效果难以完全令人满意。[0003]糖异生是