一种高效基因敲除载体的构建方法及构建的工程菌.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN106367430A(43)申请公布日2017.02.01(21)申请号201510430397.2(22)申请日2015.07.21(71)申请人中国科学院微生物研究所地址100101北京市朝阳区北辰西路1号院3号(72)发明人郭惠珊王胜(74)专利代理机构北京律和信知识产权代理事务所(普通合伙)11446代理人武玉琴刘国伟(51)Int.Cl.C12N15/66(2006.01)C12N15/74(2006.01)C12R1/01(2006.01)权利要求书1页说明书8页序列表4页附图3页(54)发明名称一种高效基因敲除载体的构建方法及构建的工程菌(57)摘要本发明提供了一种高效基因敲除载体的构建方法,本发明利用了高效负筛选标记基因与USER酶克隆技术，在载体中构建酶切位点，使载体在酶切后可以产生与USER酶酶切后的目的基因上下游片段互补的粘性末端，同时在载体中还构建了高效负筛选标记基因，并将构建的载体成功用于大丽轮枝菌V592目的基因的敲除，实验证明，利用本发明方法构建的载体大大缩短了大丽轮枝菌目的基因的研究周期，加快了大丽轮枝菌功能基因的研究。CN106367430ACN106367430A权利要求书1/1页1.一种高效基因敲除载体的构建方法,其特征在于,包括如下步骤：(1)将带有HSV-tk基因的载体PGKO-Gateway通过XbaⅠ和HindⅢ进行双酶切，回收酶切后的载体大片段；(2)将载体Psul-EGFP通过XbaⅠ和HindⅢ进行双酶切，回收酶切后的载体短片段；(3)连接步骤(1)和步骤(2)中获得的所述载体大片段和所述载体短片段，获得载体PGKO-EGFP；(4)将所述载体PGKO-EGFP用SmalⅠ和HindⅢ双酶切，回收含有HindⅢ和SmalⅠ酶切位点的载体片段；(5)以载体pRF-HU2为模板通过引物prf-pgko-s和prf-pgko-a扩增带有Nt.BbvCI和PacⅠ酶切位点的能够表达潮霉素的基因片段；(6)回收步骤(5)的扩增产物直接与步骤(4)中所述含有HindⅢ和SmalⅠ酶切位点的载体片段进行酶切连接；(7)步骤(6)的产物转化受体菌，选取经验证的阳性克隆的质粒即为所述高效基因敲除载体。2.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤(5)中所述引物prf-pgko-s和prf-pgko-a序列为：上游引物Prf-pgko-s：5’-AATTAAGGGAGTCACGAAGCTTGCT-3’；下游引物Prf-pgko-a：5’-TCCCCCGGGCGGCCAGTGAATTCGAGCTCGCT-3’。3.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述HSV-tk基因的序列如SEQIDNO.1所示。4.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述带有Nt.BbvCI酶切位点和PacⅠ酶切位点的能够表达潮霉素的基因片段的序列如SEQIDNO.2所示。5.根据权利要求1至3中任一所述的高效基因敲除载体的构建方法构建的载体。6.如权利要求4所述的载体在目的基因敲除上的应用，其特征在于，包括如下步骤：(1)PacⅠ酶切权利要求4所述的载体，获得线性载体；(2)扩增目的基因上游片段及下游片段；(3)通过USER酶连接步骤(1)所述的线性载体和步骤(2)所述的目的基因的上游片段和下游片段，测序验证阳性质粒；(4)步骤(3)中验证正确的阳性质粒转化受体菌感受态细胞，扩增培养，培养产物在含有抗生素的培养基上培养；(5)在步骤(4)中含有抗生素的培养基上选取单菌落进行PCR验证，验证正确的菌株即为敲除了目的基因的菌株。7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述步骤(2)中扩增目的基因上游片段及下游片段使用的引物的5’端分别添加如下片段：上游片段正向引物序列添加片段：5’-GGCATTAAU；上游片段反向引物序列添加片段：5’-GGTCTTAAU；下游片段正向引物序列添加片段：5’-GGGTTTAAU；下游片段反向引物序列添加片段：5’-GGACTTAAU。8.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述受体菌为农杆菌。2CN106367430A说明书1/8页一种高效基因敲除载体的构建方法及构建的工程菌技术领域[0001]本发明总地涉及生物技术领域，具体涉及一种高效基因敲除载体及其构建方法与应用。背景技术[0002]随着基因测序技术的提高和测序成本的降低，越来越多的真菌的基因组被测序(http://www.broadinstitute.org//scientific-community/data)，得到了大量的基因数据，但是欠缺有力的实验证据证明相关基因的功能，迫切需要有效的快速检测基因功能的方法的出现。当前研究最热的两种基因编辑技