壬基酚人工抗原的制备方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局*CN103012582A*(12)发明专利申请(10)申请公布号CN103012582A(43)申请公布日2013.04.03(21)申请号201210533788.3(22)申请日2012.12.12(71)申请人中国水产科学研究院长江水产研究所地址430000湖北省武汉市东湖新技术开发区武大园一路八号(72)发明人甘金华(74)专利代理机构武汉宇晨专利事务所42001代理人王敏锋(51)Int.Cl.C07K14/765(2006.01)权利要求书权利要求书1页1页说明书说明书55页页附图附图33页(54)发明名称壬基酚人工抗原的制备方法(57)摘要本发明公开了一种壬基酚人工抗原的制备方法，其步骤：(1)按摩尔比称取壬基酚和琥珀酸酐置于反应瓶中，加入DMSO作为溶剂，反应后冷却至室温，将冷却的反应液加入到超纯水中，边滴加边搅拌，溶液变成乳白色，将物质进行抽滤沉淀，用冰超纯水洗涤后抽干，烘干后重结晶，干燥得到的淡黄色油状物;(2)按摩尔比称取N-羟基琥珀酰亚胺：水溶性碳二亚胺：牛血清白蛋白共溶于lPBS中，反应过夜，离心；按摩尔比比例称取NP-HS溶解于N,N-二甲基甲酰胺中，溶解后，取上清液，边滴加边搅拌的方式加入到NP-HS溶液中，将反应后的溶液离心，取上清液，将透析的反应液置于冰箱中冷冻过夜，干燥，得壬基酚人工抗原。该方法合成步骤简单易操作，副反应少，目标物纯度高。CN103258ACN103012582A权利要求书1/1页1.一种壬基酚人工抗原的制备方法，其步骤是：(1)按摩尔比1:1.3称取壬基酚和琥珀酸酐置于500ml反应瓶中，加入DMSO作为溶剂，90℃反应1h后冷却至室温，将冷却的反应液加入到超纯水中，边滴加边搅拌，溶液变成乳白色，上面浮着一层淡黄色的油状物，将上述物质进行抽滤沉淀，用冰超纯水洗涤后抽干，50℃烘干后重结晶3次，干燥得到的淡黄色油状物为NP-HS;(2)按摩尔比30：30：1称取N-羟基琥珀酰亚胺：水溶性碳二亚胺：牛血清白蛋白共溶于0.01mol/lPBS中，4℃下搅拌反应过夜，将上述溶液离心5000r/min，10min，所得上清液为A液；按摩尔比30:6.5的比例称取NP-HS溶解于N,N-二甲基甲酰胺中，待完全溶解后，用移液枪取1/2体积的上清液A，以边滴加边搅拌的方式加入到NP-HS溶液中，避光反应3-5h，将反应后的溶液离心5000r/min，10min，上清液为B，取上清液B，以PBS溶液做透析液，置4℃透析3天，每7-9h换一次透析液，除去未反应的DMF、CDC、NHS、NP小分子物质，将透析的反应液用棕色玻璃小瓶分装后置于-40℃冰箱中冷冻过夜，然后转移到冷冻干燥机中进行干燥，获得一种壬基酚人工抗原，于-20℃冰箱保存。2CN103012582A说明书1/5页壬基酚人工抗原的制备方法技术领域[0001]本发明属于生物化工技术领域，更具体涉及一种壬基酚人工抗原的合成方法,本发明利用琥珀酸酐法，将壬基酚上面的羟基进行衍生化，以引进能够与蛋白反应的功能团。利用改进的碳二亚胺法将衍生物NP-HS与蛋白载体反应，合成相应的人工抗原，为壬基酚抗体制备提供技术支持。背景技术[0002]壬基酚（Nonylophenol，NP），是一种重要的精细化工原料和中间体，主要用于生产表面活性剂、也用于抗氧化剂、纺织印染助剂、润滑油添加剂、农药乳化剂等领域，由于NP高度疏水性及化学性质稳定，因此容易在环境中富集而广泛分布，同时通过食物链对水生生物、动物及人类造成危害。有专家表明，NP具有雌激素效应，可导致动物生殖系统的损害，同时对雄性动物的生殖功能也有影响，并对其血清中睾丸酮水平和某些生化指标产生影响。[0003]为了确保人类安全与健康，建立快速、准确监测壬基酚等有害物质的残留是十分必要的。传统的残留分析方法包括气相色谱法、液相色谱法、质谱、薄层层析等，这些方法往往需要很复杂昂贵的仪器，而且需要经过繁琐的前处理，很难达到快速、简便的现场检测要求。而免疫检测分析方法由于具有特异性强、灵敏度高、简便、快速等优点，近年来备受人们的关注。因此，建立起NP的免疫快速检测方法，对于实践中批量化测定样品中NP残留意义重大。本试验制备成功的人工抗原以及由此制备的高效价抗体，可为建立快速检测NP残留的免疫试剂盒提供可靠保证。[0004]壬基酚是小分子化合物，本身不具备免疫原性，不能直接刺激机体产生抗体，必须与连接到大分子载体上以形成较为理想的免疫原。在本实验中，用改进的碳二亚胺法合成壬基酚人工抗原NP-BSA,并对其进行鉴定。然后以此人工抗原免疫balb/c小鼠，制备单克隆抗体，对NP的ELISA检测方法进行研究。为下一步研制壬基酚残留检测试剂盒建立很好的技术平台。发明内容[0005]