一种丁香酚半抗原、人工抗原及其制备方法与应用.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN110746286A(43)申请公布日2020.02.04(21)申请号201911063843.5G01N33/68(2006.01)(22)申请日2019.11.04(71)申请人北京维德维康生物技术有限公司地址100095北京市海淀区地锦路9号院3号楼(72)发明人马立才刘河冰聂靖东邢维维贾良曦李蓉蓉(51)Int.Cl.C07C51/02(2006.01)C07C59/64(2006.01)C07K14/765(2006.01)C07K14/77(2006.01)C07K14/795(2006.01)C07K14/47(2006.01)C07K16/44(2006.01)权利要求书2页说明书9页G01N33/543(2006.01)序列表2页附图1页(54)发明名称一种丁香酚半抗原、人工抗原及其制备方法与应用(57)摘要本发明公开了一种丁香酚半抗原、人工抗原及其制备方法与应用。本发明所提供的丁香酚人工抗原为将式I所示的丁香酚半抗原与载体蛋白偶联所得的抗原。本发明所提供丁香酚人工抗原合成方法简单，纯度高和产率高，对于丁香酚抗体的制备，以及丁香酚药物残留检测具有重大价值。式I。CN110746286ACN110746286A权利要求书1/2页1.一种化合物，其结构如式I所示：式I。2.制备权利要求1所述化合物的方法，包括步骤为：丁香酚溶解于甲苯中，再加入Ph3P=CHCOOEt的甲苯溶液反应，获得反应液；所述丁香酚、甲苯、Ph3P=CHCOOEt的配比为500mg：5ml：1045mg，所述加入反应时间为5个小时，所述反应温度为80℃；反应液降温旋干，残余物经复溶、洗涤、干燥获得中间体1，中间体1加入甲醇复溶残余物，再加入氢氧化钠反应，反应液经去甲醇、调pH、萃取、干燥、旋干获得丁香酚半抗原460mg。3.丁香酚抗原，为将权利要求1所述化合物与载体蛋白偶联所得的抗原。4.根据权利要求3所述的丁香酚抗原，其特征在于：所述载体蛋白可以是牛血清白蛋白、卵清蛋白、人血清白蛋白、血蓝蛋白、鼠血清蛋白、甲状腺蛋白或兔血清蛋白。5.根据权利要求3或4所述的丁香酚抗原的制备方法，包括如下步骤：将权利要求1所述化合物与载体蛋白通过酰胺键偶联，获得所述丁香酚抗原。6.根据权利要求5所述的丁香酚抗原的制备方法，其特征在于：所述方法包括如下步骤：（1）将所述丁香酚半抗原（式I）溶解于二甲基甲酰胺（DMF）中，然后加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）和N-羟基琥珀酰亚胺（NHS），20-25℃磁力搅拌反应2-3h，得到溶液I；其中，所述丁香酚半抗原（式I）、所述二甲基甲酰胺（DMF）、所述1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）、所述N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）的配比为7.8mg：1.5ml：21.5mg：13mg；（2）将所述载体蛋白置于0.1M碳酸氢钠缓冲液中，200rpm搅拌10min，充分溶解，得到溶液II；所述载体蛋白与所述0.1M碳酸氢钠缓冲液的配比为33.6-50mg：3.5ml；（3）将所述溶液I和所述溶液II混合，具体为在0-4℃条件下，1000rpm搅拌下，将溶液I逐滴加入到所述溶液II中，500rpm搅拌反应24h，得到溶液III；（4）用磷酸盐缓冲液（0.01MPBS，pH7.2），于4℃对所述溶液III搅拌透析3天，得到所述丁香酚抗原。7.权利要求1所述化合物或权利要求3所述丁香酚抗原的应用，其特征在于定性或定量检测丁香酚；制备丁香酚抗体。8.利用权利要求3所述丁香酚抗原制备的抗体，其特征在于所述抗体为抗丁香酚单克2CN110746286A权利要求书2/2页隆抗体；所述抗丁香酚单克隆抗体的轻链可变区的氨基酸序列为1；所述抗丁香酚单克隆抗体的重链可变区的氨基酸序列为2。9.根据权利要求7所述的丁香酚抗原的应用，其特征在于可以为制备酶联免疫试剂盒和胶体金检测卡。10.根据权利要求7或9所述的丁香酚抗原的应用，其特征在于检测样本可以为水产及组织，所述检测上述样本中丁香酚的检测限为0.5μg/kg，灵敏度为0.51μg/kg。3CN110746286A说明书1/9页一种丁香酚半抗原、人工抗原及其制备方法与应用技术领域[0001]本发明属于药物残留快速检测领域，涉及一种丁香酚人工抗原及其制备方法与应用。背景技术[0002]丁香酚为芳香油中提取得到的一种难溶于水的带有芳香气味的淡黄色液体，因其麻醉效果好和成本低且休药期短而作为鱼用麻醉剂被广泛运用到鲜活水产品的运输和保鲜上，但其残留具有肝脏毒性，可引起肠胃炎和厌食症，并具有潜在的致癌性等，威胁到动物生产，通过食物链进入人体后危害人们身体健康。丁香酚在水产品收贮运环节