一种壬基酚半抗原和抗原及其制备方法和用途.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN109959785A(43)申请公布日2019.07.02(21)申请号201711400990.8(22)申请日2017.12.22(71)申请人北京维德维康生物技术有限公司地址100095北京市海淀区北清路156号环保示范园9号院3号楼(72)发明人马立才邵兵丁亚芳聂靖东段莉莉姚凯李淑芳王照鹏刘薇杨柳秦誉(51)Int.Cl.G01N33/535(2006.01)C07K14/765(2006.01)C07K14/77(2006.01)C07K14/795(2006.01)C07K14/47(2006.01)C07K16/44(2006.01)权利要求书2页说明书11页附图2页(54)发明名称一种壬基酚半抗原和抗原及其制备方法和用途(57)摘要本发明公开了一种内分泌干扰物壬基酚半抗原和抗原及其制备方法与应用。本发明所提供的壬基酚人工抗原为将式I所示的壬基酚半抗原与载体蛋白偶联所得的抗原。本发明所提供壬基酚人工抗原合成方法简单，纯度高和产率高，对于壬基酚抗体的制备，以及食品中壬基酚残留检测具有重大价值。CN109959785ACN109959785A权利要求书1/2页1.一种壬基酚半抗原，其结构为式I所示化合物：式I。2.制备权利要求1所述化合物的方法，包括步骤为：在壬基酚中加入DMF、NaH，所述壬基酚、DMF、NaH的配比为1000mg：30ml：50mg，室温反应15min获得反应液；在反应液中加入200mg4-溴丁酸乙酯，40℃油浴条件下反应，25ml乙酸乙酯萃取，蒸干，加入12mL乙酸乙酯将残留物溶解，称量2倍重量的硅胶加入其中，旋蒸干，准备硅胶柱上样；将混合好的硅胶样品使用干样加样法进行加样，用石油醚：乙酸乙酯体系淋洗，收集淋洗液，收集旋蒸产物；产物用7mL甲醇溶解，按2倍物质的量加入2MNaOH溶液，40℃下加热，水解完全后，用6M的HCl调节pH到2；将反应液用50mL乙酸乙酯萃取，收集有机相，加入无水硫酸钠；过滤，旋蒸干，得到式I所述化合物。3.壬基酚抗原，为将权利要求1所述化合物与载体蛋白偶联所得的抗原。4.根据权利要求3所述的壬基酚抗原，其特征在于：所述载体蛋白可以是牛血清白蛋白、卵清蛋白、人血清白蛋白、血蓝蛋白、鼠血清蛋白、甲状腺蛋白或兔血清蛋白。5.权利要求3或4所述的壬基酚抗原的制备方法，包括如下步骤：将权利要求1所述化合物与载体蛋白通过酰胺键偶联，获得所述壬基酚抗原；权利要求1所述化合物与所述载体蛋白偶联的摩尔比为9.4：1。6.根据权利要求5所述的壬基酚抗原的制备方法，其特征在于：所述方法包括如下步骤：（1）将所述壬基酚半抗原溶解于DMF中，然后加入EDC和NHS，20-25℃磁力搅拌反应2-3h，得到溶液I；其中，所述壬基酚半抗原、所述DMF、所述EDC、所述NHS的配比为20mg：1.5mL：21.5mg：13mg；（2）将所述载体蛋白置于0.1M碳酸氢钠缓冲液中，200rpm搅拌10min，充分溶解，得到溶液II；所述载体蛋白与所述0.1M碳酸氢钠缓冲液的配比为33.6-50mg：3.5mL；（3）将所述溶液I和所述溶液II混合，具体为在0-4℃条件下，1000rpm搅拌下，将溶液I逐滴加入到所述溶液II中，500rpm搅拌反应24h，得到溶液III；（4）用0.01MPBS，pH7.2磷酸盐缓冲液，于4℃对所述溶液III搅拌透析3天，得到所述壬基酚抗原。2CN109959785A权利要求书2/2页7.权利要求1所述化合物或权利要求3所述壬基酚抗原的应用，其特征在于定性或定量检测壬基酚；制备壬基酚抗体。8.利用权利要求3所述壬基酚抗原制备的抗体。9.根据权利要求7所述的壬基酚抗原的应用，其特征在于可以为制备酶联免疫试剂盒、胶体金检测卡和免疫亲和柱。10.根据权利要求7所述的壬基酚抗原的应用，其特征在于检测样本可以为鸡蛋、牛奶和肉类，所述检测上述样本中壬基酚的检测限为1μg/kg，灵敏度为0.1μg/kg。3CN109959785A说明书1/11页一种壬基酚半抗原和抗原及其制备方法和用途技术领域[0001]本发明属于食品中内分泌干扰素净化、检测领域，涉及一种壬基酚半抗原和抗原及其制备方法和用途。背景技术[0002]内分泌干扰物（Environmentalendocrinedisruptingchemicals，EDCs），是一种在环境中存在的干扰人或动物内分泌系统的外源性化学物质，多数通过食物链进入生物体内，引起生物体自身荷尔蒙被干扰，在血液中循环、脂肪中积累，从而导致生物体正常的生殖、发育、免疫、行为活动等生理系统异常。壬基酚（NonylPhenol，NP）是一种典型的内分泌干扰物，其结构与人和动物的雌激素十分