牛病毒性腹泻病毒荧光定量RT-PCR检测试剂盒.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局*CN103397107A*(12)发明专利申请(10)申请公布号(10)申请公布号CNCN103397107103397107A(43)申请公布日2013.11.20(21)申请号201310317769.1(22)申请日2013.07.26(71)申请人中国兽医药品监察所地址100081北京市海淀区中关村南大街8号(72)发明人徐璐王琴范学政赵启祖朱元源邹兴启陈锴(74)专利代理机构北京君智知识产权代理事务所11305代理人郑明(51)Int.Cl.C12Q1/70(2006.01)权利要求书1页权利要求书1页说明书10页说明书10页C12Q1/68(2006.01)序列表2页序列表2页附图2页附图2页(54)发明名称牛病毒性腹泻病毒荧光定量RT-PCR检测试剂盒(57)摘要本发明涉及牛病毒性腹泻病毒荧光定量RT-PCR检测试剂盒。根据GenBank公布的21条BVDV-Ⅰ和6条BVDV-Ⅱ基因组全序列及34条CSFV全长序列，利用DANMAN、PrimerExpress3.0等软件，在BVDV的保守区域设计了1对BVDV特异的简并引物和1条探针。经过反转录酶浓度、DNA聚合酶浓度、上下游引物浓度和探针浓度的优化，发明了牛病毒性腹泻病毒荧光定量RT-PCR检测试剂盒。该试剂盒可以特异性的检测BVDV所有毒株，与其他病原无交叉反应；具有更高的灵敏度，比常规RT-PCR高1个数量级；通过对20个质控样本的重复性及稳定性试验证明，本试剂盒具有良好的重复性和稳定性；对94份临床样本检测结果证实，该方法与牛病毒性腹泻病毒RT-PCR检测试剂盒的符合率为97.9％。CN103397107ACN10397ACN103397107A权利要求书1/1页1.一种牛病毒性腹泻病毒荧光定量RT-PCR检测试剂盒的应用，其特征在于该试剂盒主要用于疫苗生产中牛源原材料污染BVDV的检测以及猪和牛的BVDV感染的检测。2.如权利要求1中所述牛病毒性腹泻病毒荧光定量RT-PCR检测试剂盒，其特征在于该试剂盒含有阳性对照，阴性对照，RT-PCR反应液、反应酶、探针溶液、无酶水，其中5.5阳性对照：为BVDVOregon毒株MDBK细胞传代产物（病毒滴度为10TCID50/0.1ml），经甲醛37℃灭活后分装备用。阴性对照：为猪瘟病毒兔化弱毒株（HCLV）牛睾丸细胞培养产物，经甲醛37℃灭活后分装备用。RT-PCR反应液：每个反应包括10×PCRBuffer5μL、dNTPMixture1.5μL、BVDV-F（10μM）1.5μL、BVDV-R（10μM）3μL，共11μL，其中引物的序列为：序列1，BVDV-F：5’-(T/C)GAGT(T/C)C(G/A)TTGGATGGC(T/C)(T/G)AA(G/C)-3’序列2，BVDV-R：5’-(C/A)(A/G)(A/G)(G/A)G(C/T)GTCGAACCACTGA-3’；反应酶：每个反应包括SSⅢTM反转录酶0.3μL、TaqHSDNA聚合酶0.5μL;探针溶液：用无酶水将探针BVDV-P稀释成5μM的探针BVDV-P溶液，每个反应需3μL，探针的序列为：序列3，BVDV-P：5’-FAM-CCTGAGTACAGGG(T/G)AGTC-MGB-3’无酶水：超纯水高压灭菌后，加入终浓度为0.1%的焦碳酸二乙酯（DEPC），处理过夜，第二天高压灭菌以去除DEPC。2CN103397107A说明书1/10页牛病毒性腹泻病毒荧光定量RT-PCR检测试剂盒技术领域[0001]本发明所涉及的牛病毒性腹泻病毒荧光定量RT-PCR检测试剂盒，属于兽用生物制品领域。背景技术[0002]牛病毒性腹泻/粘膜病是由牛病毒性腹泻病毒（BovineViralDiarrheaVirus，BVDV）引起的传染病。BVDV在世界范围内广泛分布，给全球乳、肉牛带来巨大的经济损失，山羊（TOPLIFFCL,SMITHDR,CLOWSERSL,etal.PrevalenceofbovineviraldiarrheavirusinfectionsinalpacasintheUnitedStates.JAmVetMedAssoc,2009,234(4):519-529.）、绵羊、猪（TERPSTRAC,WENSVOORTG.Acongenitalpersistentinfectionofbovinevirusdiarrhoeavirusinpigs:clinical,virologicalandimmunologicalobservations.VetQ,1997,19(3):97-101.）、鹿及小袋鼠等动物都是BVDV的宿主和传染源（LINDBERGA,BROWNLIEJ,GUNNGJ,etal.The