一种高山被孢霉原生质体的制备方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN104560733A(43)申请公布日2015.04.29(21)申请号201510002091.7(22)申请日2015.01.05(71)申请人广州甘蔗糖业研究所地址510316广东省广州市海珠区石榴岗路十号(72)发明人班甲陈骏佳王帆班雯婷徐晓燕周正雄(74)专利代理机构广州嘉权专利商标事务所有限公司44205代理人郑莹(51)Int.Cl.C12N1/14(2006.01)C12R1/645(2006.01)权利要求书1页说明书4页(54)发明名称一种高山被孢霉原生质体的制备方法(57)摘要本发明公开了一种高山被孢霉原生质体的制备方法。本发明的酶解液由活性酶、渗透压稳定剂和水组成，其中活性酶的混合比为：300～375U/ml的纤维素酶、15～20mg/ml的蜗牛酶和2500～5000U/ml的溶菌酶。本发明的制备方法是将活化后的高山被孢霉接种在液体培养基中，振荡培养收集菌丝体并洗涤干净；在菌丝体中加入无菌酶解液，充分酶解后去除菌丝体碎片，收集洗涤得到原生质体。本发明的酶解液，可以高效地酶解高山被孢霉菌丝体的细胞壁，制备得到高品质的高山被孢霉原生质体，原生质体产量可达5.5×107个/ml。CN104560733ACN104560733A权利要求书1/1页1.一种制备高山被孢霉原生质体的酶解液，由活性酶、渗透压稳定剂和水组成，其特征在于：其活性酶的混合比为：300～375U/ml的纤维素酶、15～20mg/ml的蜗牛酶和2500～5000U/ml的溶菌酶。2.一种高山被孢霉原生质体的制备方法，包括如下步骤：1）将活化后的高山被孢霉接种在液体培养基中，振荡培养收集菌丝体并洗涤干净；2）在菌丝体中加入无菌酶解液，充分酶解后去除菌丝体碎片，收集洗涤得到原生质体；其中，酶解液的组成如权利要求1所述。3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：菌株在液体培养基中振荡培养的时间为15～20h。4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：按1g湿菌体中加入酶液5ml的比例将菌丝体与酶解液混合，酶解液中，纤维素酶的酶活为300～375U/ml、蜗牛酶的酶活为15～20mg/ml、溶菌酶的酶活为2500～5000U/ml。5.根据权利要求2、3或4所述的制备方法，其特征在于：酶解液的渗透压稳定剂NaCl，其在酶解液中的浓度为0.7～0.9mo1/L。6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于：酶解液的渗透压稳定剂为0.8mo1/L的NaCl。7.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：酶解的温度为29～35℃，酶解时间为1.5～6小时。8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于：酶解的温度为30～32℃，酶解时间为2～4小时。2CN104560733A说明书1/4页一种高山被孢霉原生质体的制备方法技术领域[0001]本发明涉及一种高山被孢霉原生质体的制备方法。背景技术[0002]花生四烯酸（ARA）是一种人体必需的ω-6型多不饱和脂肪酸。ARA不仅作为一种重要的结构脂类（磷脂）广泛存在于哺乳动物的器官，肌肉和血液组织中，而且还是许多具有特殊活性的二十碳酸衍生物的直接前体，ARA的药学价值，营养保健功能卓越，已在医药、食品、饲料等领域得到广泛的应用。[0003]高山被孢霉(Mortierellaalpina)是生产ARA最有潜力的菌株之一，但在研究过程中发现，油脂中ARA产量和占总脂肪酸的百分含量较低，使之成为利用微生物发酵生产ARA的技术瓶颈之一。利用传统的生物工程技术，如诱变选育以及发酵过程控制等，都无法对ARA生物合成代谢途径进行有效的调控从而突破该瓶颈难题。通过基因工程技术对高山被孢霉进行分子改造，定向选育ARA高产菌株，是提高ARA发酵生产水平和在总油脂的含量的有效途径，而构建原生质体是进行以上研究的基础和关键技术。发明内容[0004]本发明的目的在于提供一种用于制备高山被孢霉原生质体的酶解液。[0005]本发明的另一目的在于提供一种高山被孢霉原生质体的制备方法。[0006]本发明所采取的技术方案是：一种制备高山被孢霉原生质体的酶解液，由活性酶、渗透压稳定剂和水组成，其特征在于：其活性酶的混合比为：300～375U/ml的纤维素酶、15～20mg/ml的蜗牛酶和2500～5000U/ml的溶菌酶。[0007]一种高山被孢霉原生质体的制备方法，包括如下步骤：将活化后的高山被孢霉接种在液体培养基中，振荡培养收集菌丝体并洗涤干净；在菌丝体中加入无菌酶解液及渗透压稳定剂，充分酶解后去除菌丝体碎片，收集洗涤得到原生质体；其中，酶解液的组成如上所述。[0008]进一步的，菌株在液体培养基中振荡培养的时间为15～20h。[0009]进一步的，菌株的酶解步骤为