一种甘薯原生质体的制备方法.pdf

(19)国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN114934007A(43)申请公布日2022.08.23(21)申请号202210773463.6(22)申请日2022.07.01(71)申请人广东省农业科学院作物研究所地址510665广东省广州市天河区金颖路西二街18号申请人仲恺农业工程学院(72)发明人黄立飞梁雪莲赵楠谢淑燕邹宏达陈景益(74)专利代理机构北京一枝笔知识产权代理事务所(普通合伙)11791专利代理师李镇(51)Int.Cl.C12N5/04(2006.01)权利要求书1页说明书6页附图1页(54)发明名称一种甘薯原生质体的制备方法(57)摘要本发明提供了一种甘薯原生质体的制备方法，属于植物细胞生物学技术领域。包括：将甘薯材料浸泡在甘露醇溶液中进行暗培养；得到暗培养材料；将得到的暗培养材料与酶解液混合、酶解，得到原生质体；所述酶解液组分：纤维素酶RS、离析酶R10、半纤维素酶、牛血清白蛋白、吗啉乙磺酸等。采用本发明提供的方法能够获得产量高和活力强的甘薯原生质体。CN114934007ACN114934007A权利要求书1/1页1.一种甘薯原生质体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：1)将甘薯材料浸泡在甘露醇溶液中进行暗培养；得到暗培养材料；2)将所述步骤1)得到的暗培养材料与酶解液混合、酶解，得到原生质体；所述酶解液以水为溶剂，包括以下组分：质量百分含量为1.0～3.0％的纤维素酶RS、质量百分含量为1.5％的离析酶R10、质量百分含量为0.5～1.5％的半纤维素酶、质量百分含量为0.1％的牛血清白蛋白、摩尔浓度为80mM的吗啉乙磺酸、摩尔浓度为0.4～0.6M的甘露醇、摩尔浓度为100mM的氯化钾、摩尔浓度为20mM的氯化钙、摩尔浓度为20mM的氯化镁，pH值为5.5。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤2)酶解液中还包括质量百分含量为1％的蜗牛酶。3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤1)甘薯材料包括甘薯的根尖、叶片、叶柄、茎尖分生组织和愈伤组织中一种或多种。4.根据权利要求1或3所述的制备方法，其特征在于，所述甘薯材料的长度和宽度分别为0.5～1mm。5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤1)甘露醇溶液的摩尔浓度为0.6M，所述暗培养的时间为30min。6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤2)暗培养材料的质量与酶解液的体积比为1g:10ml。7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤2)酶解的条件包括：温度为28℃，振荡速度为80rpm，酶解时间为2～4h。8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，当甘薯材料为叶片时，所述酶解时间为3h；当所述甘薯材料为叶柄时，所述酶解时间为2h；当所述甘薯材料为茎尖分生组织时，所述酶解时间为4h；当所述甘薯材料为愈伤组织时，所述酶解时间为2h；当所述甘薯材料为根尖时，所述酶解时间为3.5h。9.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤2)酶解后，得到酶解物后还包括：将所述酶解物过滤，将得到的滤液离心，得到的沉淀进行洗涤，得到原生质体。10.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于，所述离心的条件包括：离心力为250g，离心时间为10min；所述洗涤使用的洗涤缓冲液为摩尔浓度为0.4M的甘露醇溶液。2CN114934007A说明书1/6页一种甘薯原生质体的制备方法技术领域[0001]本发明属于植物细胞生物学技术领域，尤其涉及一种甘薯原生质体的制备方法。背景技术[0002]甘薯(Ipomoeabatatas[L.]Lam.)，一年生草本植物，旋花科，番薯属，是一种高产而适应性强的粮食作物。块根除作主粮外，也是食品加工、淀粉和酒精制造工业的重要原料，根、茎、叶又是优良的饲料。甘薯起源于热带美洲，是世界上重要的粮食、饲料、能源以及工业原料作物，我国是世界上最大的甘薯生产和消费国。[0003]植物原生质体是指仅由原生质膜包裹的活细胞，由于没有细胞壁，常被用来作为细胞融合、体细胞杂交、遗传转化和亚细胞定位等研究的理想材料，在许多生理生化研究和植物细胞全能性的理论研究中有重要的应用价值。甘薯具有自交和同群杂交不亲和性，而细胞融合可以克服远源细胞间不亲和的问题，实现杂交及基因重组。目前为止，仍然缺乏一套完整的甘薯原生质体制备方法。发明内容[0004]有鉴于此，本发明的目的在于提供一种甘薯原生质体的制备方法，采用本发明提供的方法能够获得产量高和活力强的甘薯原生质体。[0005]为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：[0006]本发明提供了一种甘薯原生质体的制备方法，包括以下步骤：[0007]1)将甘薯材料浸泡在甘露醇溶液中进行暗培养；得到暗培养材料；[0008]2