一种杜梨原生质体的制备方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN106967670A(43)申请公布日2017.07.21(21)申请号201710360788.0(22)申请日2017.05.19(71)申请人江苏省农业科学院地址210014江苏省南京市玄武区孝陵卫钟灵街50号(72)发明人唐君常有宏蔺经李晓刚(74)专利代理机构南京苏高专利商标事务所(普通合伙)32204代理人肖明芳(51)Int.Cl.C12N5/04(2006.01)权利要求书1页说明书4页附图1页(54)发明名称一种杜梨原生质体的制备方法(57)摘要本发明属于细胞生物学及生物技术领域，公开了一种杜梨原生质体的制备方法。本发明通过杜梨材料的前处理和质壁分离处理，利用纤维素酶、离析酶和果胶酶组合酶解杜梨叶肉组织，有效实现了杜梨原生质体的制备，克服了杜梨原生质体难以分离的问题，有效建立了杜梨叶肉原生质体的制备方法。本发明为突破杜梨遗传转化瓶颈，建立杜梨细胞工程技术体系，为杜梨原生质体遗传转化、基因瞬时表达检测、原生质体融合等提供了技术依据。CN106967670ACN106967670A权利要求书1/1页1.一种杜梨原生质体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)材料的选取：选取杜梨的叶片作为处理材料，用水冲洗，消毒，并用无菌水冲洗干净待用；(2)材料的前处理：将步骤(1)得到的材料，在室温黑暗环境下进行前处理，处理后将叶片切成细叶丝；(3)质壁分离处理：将步骤(2)得到的细叶丝浸入质壁分离处理液中，在室温黑暗环境下避光处理；(4)酶解处理：将经步骤(3)质壁分离处理的细叶丝加入酶解液中，静置，避光酶解；当酶解液变绿时置于恒温摇床上震荡，促使原生质体释放出来；(5)原生质体收集：将经步骤(4)酶解的细叶丝溶液，加入等体积的等渗液，用细胞筛过滤，除去未解离组织；将滤液离心，弃上清液收集原生质体沉淀。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的步骤(1)中选取的叶片为苗龄60～90d的杜梨苗幼叶。3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的步骤(2)中前处理的时间为0.5～1h，细叶丝的宽度为0.5～1mm。4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的步骤(3)中质壁分离处理液配方如下：CPW溶液+130g/L甘露醇+0.6g/LMES，调节pH5.6～6.0。5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的步骤(3)中细叶丝与质壁分离处理液的比例为1g:20ml，避光处理时间1～3h。6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的步骤(4)中酶解液配方如下：CPW溶液+90g/L甘露醇+25g/L纤维素酶R-10+2g/L离析酶R-10+6g/L果胶酶Y-23+20mMMES，调节pH为5.6～6.0。7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的步骤(4)中细叶丝与酶解液的比例为1g:10ml，酶解温度25～28℃，酶解时间8～13h；恒温摇床的温度为25～28℃，转速为30～50rpm，震荡时间为20～30min。8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的步骤(5)中等渗液配方如下：CPW溶液+90g/L甘露醇+0.6g/LMES，调节pH5.6～6.0。9.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的步骤(5)中细胞筛为200目，离心转速为4℃、500rpm，离心时间为3～5min。2CN106967670A说明书1/4页一种杜梨原生质体的制备方法技术领域[0001]本发明属于细胞生物学及生物技术领域，特别涉及一种杜梨原生质体的制备方法。背景技术[0002]原生质体由于没有细胞壁等特点，相对于组织、器官或个体水平有其自身独有的特点：首先它可以排除细胞之间的相互影响，单独考察一个细胞的全能性；其次，原生质体是一个均一性程度很好的群体，在短时间内就可能获得大量的原生质体。研究表明，原生质体不仅可作为一个单细胞系统来研究细胞壁再生、细胞分裂与分化、摄入细胞器、病毒侵染机理、膜透性及离子转运等基础理论研究的理想材料；同时还是原生质体培养和原生质体融合的基础。[0003]近年来，植物原生质体技术得到了迅速的发展，主要表现在通过原生质体获得再生植株和建立遗传转化体系的植物种类不断增加，包括粮食作物、蔬菜、花卉、药用植物、果树等。杜梨(PyrusbetulaefoliaBunge.)是蔷薇科(Rosaceae)梨亚科(Pomoideae)梨属(Pyrus)植物，其根、叶、果实均可入药，有健胃、消食、止痢、止咳作用。杜梨由于其适应性强，耐旱，根深、发达、耐瘠薄，抗盐碱能力强，是我国主要梨砧木，在生产中被广泛应用。[0004]杜梨作为栽培梨的主要砧木，具有综合抗性。利用生物技术建立杜梨高效的遗传转化