一种高效制备灵芝原生质体的方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局*CN102876581A*(12)发明专利申请(10)申请公布号CN102876581A(43)申请公布日2013.01.16(21)申请号201110197329.8(22)申请日2011.07.14(71)申请人中国科学技术大学地址230026安徽省合肥市蜀山区金寨路96号(72)发明人陈学平张银萍李娜(74)专利代理机构合肥金安专利事务所34114代理人金惠贞(51)Int.Cl.C12N1/14(2006.01)C12N13/00(2006.01)权利要求书权利要求书1页1页说明书说明书33页页附图附图33页(54)发明名称一种高效制备灵芝原生质体的方法(57)摘要本发明涉及一种高效制备灵芝原生质体的方法。该方法包括如下操作步骤：它以灵芝为菌种，经PDA培养基活化、摇瓶发酵培养后，1%溶壁酶+0.5%纤维素酶+0.5%蜗牛酶组成的复合酶液酶解灵芝菌丝体，甘露醇洗涤和稀释后获得较高产量的灵芝原生质体，调整浓度到104～106个/ml，采用紫外线诱变后，接种到再生培养基上28℃培养。本发明分离的细胞悬液原生质体得率较高，在再生培养基上生长状态好，可满足后续细胞生物学方面的研究。CN1028765ACN102876581A权利要求书1/1页1.一种高效制备灵芝原生质体的方法，其特征是：依序包括如下步骤：（1）菌丝体制备将菌种接种到PDA斜面上，等菌丝体刚好覆盖满PDA斜面，停止培养；挑取斜面上的菌种接种到摇瓶发酵培养基，28℃150r/min摇瓶发酵96～120h；培养好的菌丝分装到50ml无菌离心管中，4℃4000r/min离心10min；用10倍的0.6M甘露醇清洗5～6次，去除残留培养基；（2）菌丝体酶解复合酶液：1%溶壁酶+0.5%纤维素酶+0.5%蜗牛酶；酶液用0.6M甘露醇配制后-20℃低温保存备用；30℃300r/min强烈震荡酶解菌丝体150min；（3）原生质体分离酶解完成后，立即分装到50ml无菌离心管中4℃4000r/min离心10min，酶液转移后再离心分离一次，合并两次离心的沉淀；沉淀用0.6M甘露醇清洗5～6次（10倍体积），每次的清洗液再分离一次；（4）收集原生质体分离的沉淀合并后，用0.6M甘露醇重悬；1500r/min离心10min，转移上清，沉淀再用甘露醇清洗5～6次，分离上清，最后的沉淀（细胞碎片和培养基杂质）弃去；合并上清，分装到50ml离心管后500r/min离心10min，保存上清，沉淀合并后再清洗几次；最后获得的上清3000r/min离心10min即可获得原生质体；（5）原生质体的稀释剂保存最后的沉淀用甘露醇溶解并稀释；血球计数板计数，调整浓度到104～106个/ml；4℃保存，用于后续的诱变及再生；（6）诱变采用紫外线作为诱变剂，取稀释后的原生质体涂布到再生培养基上，28℃培养120～144h。2.如权利要求1所述的一种高效制备灵芝原生质体的方法，其特征是：甘露醇的浓度为0.6M。3.如权利要求1所述的一种高效制备灵芝原生质体的方法，其特征是：所述步骤（1）菌种接种到摇瓶发酵培养基培养的条件是28℃150r/min摇瓶发酵96～120h。4.如权利要求1所述的一种高效制备灵芝原生质体的方法，其特征是：所述步骤（2）复合酶液的成分为：质量百分含量为1%溶壁酶；质量百分含量为0.5%纤维素酶；质量百分含量为0.5%蜗牛酶；所述酶液的pH值为5.8。5.如权利要求1所述的一种高效制备灵芝原生质体的方法，其特征是：所述步骤（2）复合酶液酶解菌丝体的温度为30℃，酶解时间为150min。6.如权利要求1所述的一种高效制备灵芝原生质体的方法，其特征是：所述步骤（6）紫外线作为诱变剂，，紫外灯功率20W，照射距离30cm，照射时间为50s。2CN102876581A说明书1/3页一种高效制备灵芝原生质体的方法技术领域[0001]本发明属于细胞生物学领域，具体涉及一种高效制备灵芝原生质体的方法。背景技术[0002]灵芝是一种珍贵的中药材。灵芝含有多种药用活性成分，具有抗HIV，抗肿瘤等药理活性。天然灵芝品种中，有效成分含量相对较低。通过传统的生物育种方法，培育高产量的新品种具有很大的经济价值和社会价值。灵芝新品种的获得可以通过诱变产生。通过物理和化学复合诱变培育新品种为越来越多的研究者所采用。灵芝的诱变通常有孢子体诱变和原生质体诱变两种方法。[0003]孢子体有坚韧的外壳，需要强烈的诱变刺激（如Co60+UV复合诱变），诱变难度大，突变几率小，诱变后不容易筛选且筛选周期长。原生质体诱变是一种间接的诱变方法，具有简便快速，筛选方便等诸多优点，克服了孢子体诱变的多种缺点。在原生质体诱变中，高质量的原生质体对诱变及筛选的成功至关重要。虽然灵芝原生质体的制备已有相