一种鸡胚前脑神经元的培养方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN105400739A(43)申请公布日2016.03.16(21)申请号201510951727.2(22)申请日2015.12.16(71)申请人北京大学深圳研究院地址518000广东省深圳市南山区高新区南区七路深港产学研基地大楼西座W803(72)发明人盛立远赖琛甄珍都贝宁魏利娜王巧莉高志奚廷斐(74)专利代理机构广州嘉权专利商标事务所有限公司44205代理人唐致明(51)Int.Cl.C12N5/0793(2010.01)权利要求书1页说明书6页附图5页(54)发明名称一种鸡胚前脑神经元的培养方法(57)摘要本发明涉及神经元培养，具体是一种鸡胚前脑神经元的培养方法，所述培养方法包括：鸡胚前脑神经组织的获取，用聚乙烯亚胺包被培养装置，用含小牛血清的Neurobasal培养基培养鸡胚前脑神经元。本发明的方案可以使鸡胚前脑神经元在高密度条件下长时间培养；免疫染色结果证明有神经元和胶质细胞共存，并且在第7天已经有突触的形成；随着胶质细胞的增殖，在MEA上的神经网络最后长成非常致密的细胞层，可存活长达6个月；CFBN神经网络对神经活性物质有很好的反应性，可以用作神经毒性检测平台。CN105400739ACN105400739A权利要求书1/1页1.一种鸡胚前脑神经元的培养方法，其特征在于，所述培养方法包括：用含小牛血清的Neurobasal培养基培养鸡胚前脑神经元。2.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，所述培养方法还包括：用聚乙烯亚胺包被培养装置。3.根据权利要求2所述的培养方法，其特征在于，所述聚乙烯亚胺包被培养装置具体为：在细胞培养皿、24孔板或者微电极阵列中加入0.05wt%聚乙烯亚胺溶液，放入培养箱过夜，第二天用去离子水洗涤，干燥后待用。4.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，所述小牛血清的添加量占培养基2wt%。5.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，所述鸡胚前脑神经元按照以下步骤获得：S11、取第7~9天的受精鸡蛋，消毒，用镊子将鸡蛋头部敲碎，去壳，拨开壳膜，取出鸡胚放到装有HBSS的培养皿；S12、用镊子将鸡胚的头截断，放入另一个有HBSS的培养皿；S13、加鸡胚的头部背面朝上置，压住中脑部位，并把前脑的脑膜揭开，取出两团白色的组织，放于有HBSS的培养皿，将贴附在白色组织外面残余的脑膜去掉，得到前脑组织；S14、将前脑组织放入离心管，加入冰疗的HBSS溶液；S15、吸出HBSS溶液，加入温热的胰酶EDTA溶液消化；S16、加入M199培养基终止消化，反复吹打，形成均匀的细胞悬液；S17、离心取上清，加入M199培养基，吹打均匀。6.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，所述培养方法具体为：将鸡胚前脑神经元的细胞悬浮液加入培养装置，均匀分散，然后放入培养箱培养，之后将细胞液全部换成含小牛血清的Neurobasal培养基，以后每1~3天换一半的培养基。7.根据权利要求6所述的培养方法，其特征在于，所述培养方法具体为：S21、将鸡胚前脑神经元悬浮液的细胞密度调节为3*106/mL，滴20μL悬浮液于微电极阵列中央电极处，最终密度为1500~2000个/mm2；S22、将微电极阵列放入100mm的培养皿，然后放入37℃、5%CO2、95%湿度的培养箱培养；S23、待细胞完全贴壁后加入1mLM199培养基，放入培养箱继续培养；S24、24h后将细胞液全部换成含小牛血清的Neurobasal培养基，之后每3天换一半的培养基。8.根据权利要求7所述的培养方法，其特征在于，步骤S21后在微电极阵列套上带有聚全氟乙丙烯膜的密封环。2CN105400739A说明书1/6页一种鸡胚前脑神经元的培养方法技术领域[0001]本发明涉及神经元培养，具体是一种鸡胚前脑神经元的培养方法。背景技术[0002]鸡胚前脑神经元（CFBN），类似于哺乳类大脑皮层神经元，来源广泛，操作简单，成本低廉，常用作体外神经细胞毒性检测的模型之一。早在1993年，Weiss等人就用CFBN模型做过多中心体外细胞毒性检测评价（MEIC），发现和啮齿类动物（鼠科）的体外实验数据高度相关，并且和啮齿类动物的体内实验数据也具有可比性。但是相比于啮齿动物的大脑皮层细胞培养，目前对专门对CFBN细胞培养的报道很少。Heidemann等的研究方法主要针对低密度、短时间的细胞培养。但是低密度的神经网络很难用微电极阵列（MEA）检测出电生理信号。根据啮齿类皮层细胞体外神经网络的发育过程，电生理信号需要在3~4周才能保持稳定，才能用作电生理神经毒性的检测。因此，需要探索一种CFBN长期培养的方法。[0003]虽然鸟类的脑部三维结构比哺乳类的简单，但是当他们被提取出来并且在体外进行二维平