一种鸡胚原代肝细胞的分离培养方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN113564102A(43)申请公布日2021.10.29(21)申请号202110966404.6(22)申请日2021.08.23(71)申请人江西农业大学地址330000江西省南昌市志敏大道1101号(72)发明人杨帆幸程鸿曹华斌胡国良张彩英彭俊俊(74)专利代理机构南昌卓尔精诚专利代理事务所(普通合伙)36133代理人徐柳华(51)Int.Cl.C12N5/071(2010.01)C12N5/073(2010.01)权利要求书1页说明书4页附图3页(54)发明名称一种鸡胚原代肝细胞的分离培养方法(57)摘要本发明适用于生物技术领域，提供了一种鸡胚原代肝细胞的分离培养方法，包括步骤如下：步骤一：将孵化至12日龄的鸡胚经75%乙醇浸泡消毒后放入无菌操作台；步骤二：无菌条件下取出步骤一中鸡胚，将鸡胚断头处理后置于含有4℃预冷的0.01mol/L磷酸缓冲盐溶液中；步骤三：对步骤二中处理后的鸡胚进行两次清理后，使鸡胚表面的血液清洗掉。采用SPF级鸡胚，在操作台中即可完成肝脏的分离，在操作简便的同时又不易出现细菌污染。方法中利用胶原酶对肝进行组织消化，相较于传统的胰蛋白酶消化法，对细胞造成的损伤较小且胶原酶造成的损伤是可逆性的，能获得的生物活性较好的肝细胞。CN113564102ACN113564102A权利要求书1/1页1.一种鸡胚原代肝细胞的分离培养方法，其特征在于，包括步骤如下：步骤一：将孵化至12日龄的鸡胚经75％乙醇浸泡消毒后放入无菌操作台；步骤二：无菌条件下取出步骤一中鸡胚，将鸡胚断头处理后置于含有4℃预冷的0.01mol/L磷酸缓冲盐溶液中；步骤三：对步骤二中处理后的鸡胚进行清理，将鸡胚表面的血液清洗掉；步骤四：将步骤三清洗后的鸡胚放入无菌培养皿中，利用无菌眼科镊和眼科剪剖腹将肝脏取出，浸泡于4℃预冷的磷酸缓冲盐溶液中；步骤五：将步骤四中肝脏剪成1mm3大小的小块后收集在50mL的离心管中；步骤六：对离心管中肝脏碎块进行磷酸缓冲盐溶液清洗3次，每次1min；步骤七：将磷酸缓冲盐溶液弃去后加入足够覆盖所有组织的胶原酶消化液，在37℃水浴锅中消化15min，整个过程持续摇晃以增加所有肝脏组织和胶原酶的接触；步骤八：消化结束后用含10％胎牛血清的DMEM基础培养基终止消化；步骤九：结束消化后，用5mL的移液枪将细胞吹打下来，分别经过200目和400目的细胞筛进行滤过；步骤十：将细胞液收集后经100g离心5min；步骤十一：使用DMEM培养液清洗细胞泥两次后使用适量的基础培养基重悬细胞，台盼蓝染色后，显微镜下计数；步骤十二：用基础培养基将细胞密度调整至1×106个/mL，然后接种于细胞培养板或培养瓶中；步骤十三：所述细胞培养板或培养瓶置于温度为37℃、5％CO2培养箱中培养，24h后再换液一次。2.根据权利要求1所述的鸡胚原代肝细胞的分离培养方法，其特征在于，所述步骤一中鸡胚采用旋转孵化箱进行孵化。3.根据权利要求2所述的鸡胚原代肝细胞的分离培养方法，其特征在于，所述旋转孵化箱孵化过程中温度参数为37.5℃，湿度为70％。4.根据权利要求1所述的鸡胚原代肝细胞的分离培养方法，其特征在于，所述步骤七中胶原酶消化液预热处理到37℃。5.根据权利要求1所述的鸡胚原代肝细胞的分离培养方法，其特征在于，所述步骤八中DMEM基础培养基配方为：2mmol/L的L‑谷氨酰胺、5μg/mL转铁蛋白、10‑7mol/L地塞米松、10‑7mol/L牛胰岛素、10mmol/L的HEPES缓冲液、1％双抗的DMEM基础培养液。6.根据权利要求5所述的鸡胚原代肝细胞的分离培养方法，其特征在于，所述10mmol/L的HEPES缓冲液pH值为7.0。7.根据权利要求1所述的鸡胚原代肝细胞的分离培养方法，其特征在于，所述步骤十二中细胞培养板为6孔细胞板。2CN113564102A说明书1/4页一种鸡胚原代肝细胞的分离培养方法技术领域[0001]本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种鸡胚原代肝细胞的分离培养方法。背景技术[0002]目前，国内有关鸡胚原代肝细胞培养方法的较少。体外培养的鸡胚原代肝细胞，不仅能够保持肝脏的许多特有功能，而且具有较好的体外试验重现性，因此已被越来越多地运用到研究禽类肝脏生物学功能和代谢功能领域中。[0003]然而无论是哺乳动物还是禽类的原代离体肝细胞，均存在体外培养要求条件高、存活时间短、纯度低、增殖困难等问题，尤其在鸡肝细胞分离过程出现的污染。发明内容[0004]本发明实施例的目的在于提供一种鸡胚原代肝细胞的分离培养方法，旨在解决鸡肝细胞分离过程出现的污染的问题。[0005]本发明实施例是这样实现的，一种鸡胚原代肝细胞的分离培养方法，包括步骤如下：步骤一：