一种鸡胚蛋性别快速鉴定方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN106834460A(43)申请公布日2017.06.13(21)申请号201710049896.6(22)申请日2017.01.23(71)申请人扬州大学地址225009江苏省扬州市大学南路88号(72)发明人李碧春靳锴左其生(74)专利代理机构扬州苏中专利事务所(普通合伙)32222代理人许必元(51)Int.Cl.C12Q1/68(2006.01)权利要求书1页说明书4页序列表1页附图8页(54)发明名称一种鸡胚蛋性别快速鉴定方法(57)摘要本发明公开了一种新的鸡胚蛋性别快速鉴定方法：种蛋孵化至16、17或18日龄，通过1ml注射器于胚蛋尖端无菌获取尿囊液（10μL），取样后石蜡封口进行正常孵化；以取得的尿囊液为模板，设计CDH-W特异性引物进行PCR扩增，通过凝胶电泳检测扩增产物并进行性别鉴定：雄性扩增为双带（600bp和450bp），雌性为单带（450bp）；正常孵化出雏后统计孵化率和死亡率并与对照组进行生物统计学分析；对比性别鉴定的结果和出雏后仔鸡的剖检结果，进行关联分析，统计性别鉴定的准确率（准确率达99%，视为100%有效）。CN106834460ACN106834460A权利要求书1/1页1.一种鸡胚蛋性别快速鉴定方法，其特征在于，所述鉴定方法包括以下步骤：（1）16、17或18天胚龄胚蛋尿囊液采集胚蛋正常孵化至16、17或18日胚龄，使用1ml注射器通过胚蛋尖端位置取尿囊液；（2）CDH-W特异引物性别鉴定根据CDH-W在鸡NCBI数据库中CDS序列设计引物，引物序列为：上游Forward:5’-TGCAGAAGCAATATTACAAG-3’；下游Reward:5’–AATTCATTATCATCTGGTGG-3’；以取得的尿囊液为模板，直接进行PCR扩增，通过凝胶电泳检测扩增产物，通过扩增产物大小对胚蛋的性别进行鉴定分别扩增ZW染色体不同片段，雄性扩增为双带，即600bp和450bp，雌性为单带，即450bp。2.根据权利要求1所述的鸡胚蛋性别快速鉴定方法，其特征在于：所述尿囊液的取样量为10μL，取样前用酒精擦拭胚蛋取样位置，取样后使用石蜡封口后继续进行孵化，鉴定无需对样品进行处理。2CN106834460A说明书1/4页一种鸡胚蛋性别快速鉴定方法技术领域[0001]本发明涉及家禽养殖、性别鉴定、发育生物学和组织与细胞工程等领域，具体涉及一种鸡胚蛋性别快速鉴定方法。背景技术[0002]鸡性别鉴定在养殖业和发育生物学研究中具有十分重要的意义，在蛋用鸡群中，母鸡的经济价值要高于公鸡；而在肉用鸡群中，公鸡的经济价值高于母鸡。同时家鸡也是鸟类基础研究和发育生物学的模式动物。因此，在鸡出壳之前对鸡进行性别鉴定能够在很大程度上减少成本，节约人力物力；也能为相关研究提供实验基础。目前国内外对鸡胚性别鉴定的方法已有大量报道。目前主要有形态学方法、细胞生物学方、DNA含量方法和激素含量测定法等多种方法，但是在多种方法中，PCR方法以其易于取材，操作简便，准确率高等特点具有明显的优越性。Clinton等报道了一种快速的PCR鉴定方法，利用提取的4.5天胚蛋的组织提取DNA进行鉴定。李治利等则利用PCR技术对12和16天胚蛋进行全血采集后提取血液基因组进行鉴定。王嘉利等改进样本采集方法，对12.5胚蛋采集的尿囊液和羊水进行处理后进行PCR鉴定。虽然大量研究表明PCR方法在鸡胚性别鉴定中可行性较高，但是在样本采集后仍需要进一步处理，且存在各种各样的问题而难以进行推广，还需要进一步的优化和改进。发明内容[0003]本发明目的在于提供一种新的鸡胚蛋性别快速鉴定方法，采用本方法，能够实现在鸡胚胎时期快速取样进行性别鉴定，鉴定准确率100％，本方法无需对样本进行处理，鉴定步骤更为简便可行，且对鸡胚正常孵化和发育无影响，这是目前在其他方法中没有提及的一种新方法。[0004]本发明的目的通过以下技术方案实现的，一种鸡胚蛋性别快速鉴定方法，包括以下步骤：[0005](1)16，17，18天胚龄胚蛋尿囊液采集[0006]胚蛋正常孵化至16，17，18日胚龄，使用1ml注射器通过胚蛋尖端位置取尿囊液(取样量：10μL)，取样前用酒精擦拭胚蛋取样位置，取样后使用石蜡封口后继续进行孵化。[0007](2)CDH-W特异引物性别鉴定[0008]根据CDH-W在鸡NCBI数据库中CDS序列设计引物，分别扩增ZW染色体不同片段，雄性扩增为双带(600bp和450bp)，雌性为单带(450bp)。引物序列为：上游Forward:5’-TGCAGAAGCAATATTACAAG-3’；下游Reward:5’–AATTCATTATCATCTGGTGG-3’。以取得的尿囊液为模板，直接进行