一种脐带动脉和静脉血管周干细胞的制备和保存方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN105695401A(43)申请公布日2016.06.22(21)申请号201610189133.7(22)申请日2016.03.29(71)申请人南京大学医学院附属鼓楼医院地址210008江苏省南京市鼓楼区中山路321号(72)发明人丁利军孙海翔徐璐(74)专利代理机构南京钟山专利代理有限公司32252代理人李小静(51)Int.Cl.C12N5/0775(2010.01)A01N1/02(2006.01)权利要求书1页说明书5页附图2页(54)发明名称一种脐带动脉和静脉血管周干细胞的制备和保存方法(57)摘要本发明公开了一种脐带动脉和静脉血管周干细胞的制备和保存方法，通过细胞培养液(DMEM低糖、10％胎牛血清、1％青链霉素双抗)进行培养。本发明操作均在严格无菌条件下进行，脐带采集后抗凝剂的使用有效避免了血液凝固造成的不便。本发明的方法比普通的贴片法获得更高纯度的脐带血管周来源的间充质干细胞；不采用消化酶，避免了动物源性蛋白引起的过敏反应和交叉感染，而且非酶原消化法分离得到的脐带血管周干细胞比华通氏胶来源的间充质干细胞CD146阳性率更高。CN105695401ACN105695401A权利要求书1/1页1.一种脐带动脉和静脉血管周干细胞的制备方法，包括以下步骤：1)在无菌条件下于健康产妇分娩后立即取新生儿脐带，挤出脐带血管内血液，将其放入提前盛有含5％青链双抗、1％肝素、磷酸盐缓冲盐的广口瓶中，放在4℃保存，4h内进行脐带间充质干细胞的分离与培养；2)从步骤1)中广口瓶中取出新生儿脐带，剪去有钳夹痕及血肿的部分，挤出脐带中的血，用剪刀修齐两断面，用眼科剪将脐带纵向剪开，用镊子钝性分离动脉血管和静脉血管，将血管外膜周围紧贴血管的胶组织剔除干净；3)步骤2)处理后将脐动脉、脐静脉分别用预热的磷酸盐缓冲盐清洗，将血迹完全洗净；用剪刀将脐静脉、脐动脉剪成约0.5cm的小段，分别在培养皿中整齐排开，钝性按压，使组织块尽可能紧贴在皿底；4)步骤3)处理后放置在5％CO2、37℃培养箱内，倒置培养3小时；5)步骤4)处理后加入细胞培养液，然后置于5％CO2、37℃培养箱内继续培养，培养至4-5天时将培养皿从培养箱中取出，补加适量细胞培养液，每隔2-3天补加细胞培养液，至第11-14天时清除所有组织片并继续培养；此后每2-3天更换一次细胞培养液，所述细胞培养液由DMEM低糖、10％胎牛血清、1％青链霉素双抗组成；6)当培养皿中的贴壁细胞达到80％-90％融合时，弃去培养基，用适量磷酸缓冲盐溶液清洗，加入0.25％胰酶消化，置于5％CO2、37℃培养箱孵育60-90s，倒置显微镜下观察消化细胞，若胞质回缩，细胞之间不再连接成片，表明此时细胞消化适度；轻轻从侧部拍打培养皿数下，加入适量的细胞培养液，反复吹打，使脐带血管周干细胞尽可能混于消化液中；后将悬液吸至离心管中，1250rpm离心5min，弃上清，重新用细胞培养液悬浮细胞，接种于100mm培养皿中进行传代培养；此后每2-3天换液一次，直至融合率达到80-90％后，消化传代；7)扩增后细胞进行病原生物学检测，同时进行表型检测。2.一种权利要求1所制备的脐带动脉和静脉血管周干细胞的保存方法，其特征在于：包括以下步骤：将人脐带间充质干细胞用0.25％胰酶消化，1250rpm、5min离心收集细胞，负压吸引器吸掉离心管中细胞上清，先沿离心管口稍下方侧壁缓慢加入预计冻存液的一半，再将吸管的头部伸入液面以下缓慢加入另一半冻存液后，轻轻吹打混匀后将细胞悬液分装于冻存管中，所述冻存液由90％胎牛血清、10％二甲基亚砜组成；冻存管置于4℃保持30分钟，然后置于-20℃下保持2小时，再置于-80℃下保持16-18小时后液氮罐长期储存。2CN105695401A说明书1/5页一种脐带动脉和静脉血管周干细胞的制备和保存方法技术领域[0001]本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种脐带血管壁制备和保存间充质干细胞的方法，从血管周围组织分离间充质干细胞。背景技术[0002]近年来，国内外已经认识到成体干细胞可以作为组织工程、细胞治疗或基因治疗的种子细胞，但仍然存在异体移植免疫排斥、来源困难、体外扩增不易控制等成体干细胞应用的主要障碍。分离扩增成体干细胞以提供充足的可移植细胞，是应用的关键。[0003]间充质干细胞是成体干细胞的一种，来源于发育早期中胚层，因具有高度自我更新、免疫调控和多向分化潜能而备受关注。间充质干细胞广泛存在于全身各种组织中，特别是骨髓、脂肪组织、脐血。临床研究中的间充质干细胞主要来自骨髓。目前传统的方法是在全麻或椎管内麻醉下从骨髓中取得干细胞，但每毫升的骨髓中仅能获取100～1000集落生成单位的骨髓间充质干细胞，