一种脐带血干细胞分离制备方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN112029726A(43)申请公布日2020.12.04(21)申请号202010925834.9(22)申请日2020.09.04(71)申请人中康再生医学科技（海南）有限公司地址570000海南省海口市秀英区南海大道226号海口国家高新区创业孵化中心A楼5层A9-5室(72)发明人李伟王熙凯赵庆义(51)Int.Cl.C12N5/0789(2010.01)权利要求书1页说明书4页(54)发明名称一种脐带血干细胞分离制备方法(57)摘要本发明涉及一种脐带血干细胞分离制备方法，具体包括以下步骤：S1，脐带血的采集；S2，将脐带血预处理样品按体积比1:1加入含有脑蛋白水解物和生理盐水的稀释剂，得到稀释细胞液；S3，在稀释液中，加入红细胞沉淀剂，移取上层细胞液分装至离心管中，分三步进行梯度离心分离；S4，移取中层脐带血干细胞至另一离心管内；S5，在收集脐带血干细胞的离心管内加入生理盐水进行稀释，轻轻混匀后进行离心分离，离心分离的条件设置500g×5min，离心后再用生理盐水洗涤沉淀层；其中，所述的生理盐水中含有浓度为1‑3％的脑蛋白水解物，最后收集离心管底部的脐带血干细胞。本发明所述的脐带血干细胞分离制备方法可大批量分离纯化脐带血干细胞，且干细胞回收率高、活性高。CN112029726ACN112029726A权利要求书1/1页1.一种脐带血干细胞分离制备方法，其特征在于，包括以下步骤：S1，脐带血的采集：在产妇胎盘脱落后，使用含枸橼酸钠或肝素的抗凝液的采血袋，将采血袋上的针头插入脐静脉中，一边采集一边轻轻晃动采血袋，使抗凝液与脐带血充分混合，得到脐带血预处理样品；S2，将脐带血预处理样品倒入大容量无菌培养瓶中，按体积比1∶1向培养瓶中加入含有脑蛋白水解物和生理盐水的稀释剂，盖上瓶盖，摇匀，得到稀释细胞液；S3，在步骤S2得到的稀释液中，加入红细胞沉淀剂；混合均匀后，静止30-60分钟，观察到有明显分层，且分层不再变化时，移取上层细胞液分装至离心管中，进行梯度离心分离，所述梯度离心分离，分三步进行：第一步，设置离心条件：300g×5min；第二步设置离心条件：600g×5min；第三步设置离心条件为：1100g×5min；S4，离心完毕后，离心管内的细胞液分为三层，上层为血浆，中层为脐带血干细胞，下层为红细胞，移取中层脐带血干细胞至另一离心管内；S5，在收集脐带血干细胞的离心管内加入生理盐水进行稀释，轻轻混匀后进行离心分离，离心分离的条件设置为500g×5min，离心后再用生理盐水洗涤沉淀层；其中，所述的生理盐水中含有浓度为1-3％的脑蛋白水解物，最后收集离心管底部的脐带血干细胞。2.根据权利要求1所述的一种脐带血干细胞分离制备方法，其特征在于，在步骤S2中，所述稀释剂中，脑蛋白水解物的质量分数为0.5-10％，生理盐水中氯化钠的质量分数为8-20％。3.根据权利要求2所述的一种脐带血干细胞分离制备方法，其特征在于，在步骤S2中，所述脑蛋白水解物的质量分数为5％，生理盐水中氯化钠的质量分数为10％。4.根据权利要求1所述的一种脐带血干细胞分离制备方法，其特征在于，步骤S3中，所加入的红细胞沉淀剂体积为稀释液体积的一半，所述红细胞沉淀剂由质量分数为10-20％的羟乙基淀粉溶液组成，该溶液以8％氯化钠的生理盐水为溶剂。5.根据权利要求1所述的一种脐带血干细胞分离制备方法，其特征在于，步骤S3中，所加入的红细胞沉淀剂体积为稀释液体积的一半，所述红细胞沉淀剂由质量分数为10-20％的甲基纤维素溶液组成，该溶液以8％的生理盐水为溶剂。2CN112029726A说明书1/4页一种脐带血干细胞分离制备方法技术领域[0001]本发明涉及一种脐带血干细胞的分离制备方法，具体涉及一种可大批量分离纯化脐带血干细胞，且干细胞回收率高、活性高的分离方法。背景技术[0002]脐带血造血干细胞是所有血细胞和免疫细胞的起源细胞，具有自我更新，多向分化和自我复制的潜能，可用于白血病、免疫系统疾病、先天性免疫疾病、自身免疫性疾病、实体肿瘤、卵巢癌、神经母细胞瘤等疾病的治疗。[0003]目前，将脐带血干细胞从脐带血中进行分离的技术称为：脐血分离技术。该技术主要用于去除脐血中的红细胞、血小板和部分血浆，收集富含脐血干/祖细胞的有核细胞，通过分离使脐血浓缩和纯化，提高脐血干/祖细胞的浓度以满足研究和保存的需要。现有的脐血分离技术主要分为以下几种：羟乙基淀粉沉淀法、Percoll溶液密度梯度离心法、单克隆抗体加流式细胞仪分析法、免疫磁珠分选法、氯化铵溶解法、血细胞分离机法和培养扩增法等。以上几种分离提取方法都可以实现脐血干细胞的分离，但是在实际应用过程中，主要存在以下缺陷：(1)不能保证干细胞的