香港牡蛎精子超低温冷冻保存以及激活方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利(10)授权公告号(10)授权公告号CNCN103141472103141472B(45)授权公告日2014.11.26(21)申请号201310087708.0lateembryosandearlylarvaeintheoysterandhardclam.《Aquaculture》.1997,(第155(22)申请日2013.03.19期),(73)专利权人广西壮族自治区水产研究所李赟等.太平洋牡蛎精液的超低温保地址530021广西壮族自治区南宁市青山路存.《青岛海洋大学学报》.2002,第32卷(第28号期),(72)发明人李咏梅杨春玲陈秀荔彭敏李赟等.太平洋牡蛎精液的超低温保蒋伟明存.《青岛海洋大学学报》.2002,第32卷(第2(74)专利代理机构广西南宁汇博专利代理有限期),公司45114审查员孙啸震代理人郭平香(51)Int.Cl.A01N1/02(2006.01)A01K61/00(2006.01)(56)对比文件CN101062058A,2007.10.31,US2007298406A1,2007.12.27,Nai-HsienChao等.Cryopreservationof权利要求书1页权利要求书1页说明书6页说明书6页(54)发明名称香港牡蛎精子超低温冷冻保存以及激活方法(57)摘要本发明公开香港牡蛎精子超低温冷冻保存方法，包括香港牡蛎精子采集、稀释和冷冻，其特征在于：所述稀释是用由基础液和抗冻剂组成的稀释液对香港牡蛎精子进行稀释、平衡；所述冷冻是采用程序降温法进行冷冻，最终在液氮中保存。经上述步骤冷冻保存的香港牡蛎精子激活方法，包括解冻和激活步骤，所述解冻，是将液氮保存精子取出，在35～55℃恒温水浴解冻至完全融解；所述激活，是向复苏后精子中添加终质量浓度为0.1563～0.6250‰的氨海水。通过本发明提高了香港牡蛎精子成活率、活力、受精率及孵化率，可以加快香港牡蛎的育种进程，为今后香港牡蛎育种的发展及良种的规模化苗种繁育提供帮助，在香港牡蛎种质资源的保存和生物多样性的保护研究方面意义重大。CN103141472BCN103472BCN103141472B权利要求书1/1页1.一种香港牡蛎精子超低温冷冻保存方法，包括香港牡蛎精子采集、稀释和冷冻，其特征在于：所述稀释是用由基础液和抗冻剂组成的稀释液对香港牡蛎精子进行稀释、平衡，所述基础液是由柠檬酸钠和甘氨酸组成的溶液或生理盐水溶液，所述柠檬酸钠和甘氨酸组成的溶液，其配方为：柠檬酸钠0.1～0.3mol/L，甘氨酸0.2～0.4mol/L，余量为无菌蒸馏水；所述生理盐水溶液的质量浓度为0.6～0.9％；所述抗冻剂由二甲基亚砜和海藻糖组成，二甲基亚砜在稀释液中的体积含量为10％～14％，海藻糖在稀释液中含量为0.25～0.45mol/L；所述冷冻是采用程序降温法进行冷冻，所述程序降温法是将稀释后的精液从4℃以-5℃/min的降温速率降至-20℃，在-20℃平衡5min，再从-20℃以-10℃/min的速率降至-80℃，在-80℃平衡5min，最后取出投入-196℃～-198℃液氮罐中保存。2.根据权利要求1所述的香港牡蛎精子超低温冷冻保存方法，其特征在于：所述稀释液是按体积比20～80∶1加入精液中进行稀释。3.根据权利要求1所述的香港牡蛎精子超低温冷冻保存方法，其特征在于：所述平衡是将稀释液与精液混匀后在3～5℃条件下平衡10～60min。4.一种如权利要求1～3中任一项所述的香港牡蛎精子超低温冷冻保存方法的激活方法，包括解冻和激活步骤，其特征在于：所述解冻，是将液氮保存精子取出，在35～55℃恒温水浴解冻至完全融解；所述激活，是向复苏后精子中添加终质量浓度为0.1563～0.6250‰的氨海水。2CN103141472B说明书1/6页香港牡蛎精子超低温冷冻保存以及激活方法技术领域[0001]本发明属于精子超低温冷冻技术领域，特别是一种香港牡蛎精子超低温冷冻保存以及激活方法。背景技术[0002]香港牡蛎（Crassostrearivularis）隶属瓣鳃纲，牡蛎目，牡蛎科。是我国常见的具有经济价值的贝类。香港牡蛎是广西海水养殖业的主要养殖对象，广西沿海是香港牡蛎主要原产地。近年来，养殖的香港牡蛎发生大规模死亡，产量不断下滑，效益下降。种质退化及苗种短缺是香港牡蛎养殖业发展的首要制约因素，开展香港牡蛎良种选育及规模化苗种繁育的研究迫在眉睫。[0003]目前精子冷冻在猪、牛、羊、犬等哺乳动物和人类中技术较为成熟，水生动物中的鱼类、马氏珠母贝、太平洋牡蛎精子冷冻也有报道，查到如下相关文献：[0004]1.申请号：200710156398.8，发明名称：猪精液冷冻保存管及其猪精液冷冻保存方法，其猪精液冷冻保存方法