一种蜜蜂精子超低温冷冻保存的方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN112931490A(43)申请公布日2021.06.11(21)申请号202110364557.3(22)申请日2021.04.02(71)申请人吉林省养蜂科学研究所（吉林省蜂产品质量管理监督站、吉林省蜜蜂遗传资源基因保护中心）地址132000吉林省吉林市丰满街园林路47号(72)发明人李志勇庄明亮王志李剑飞牛庆生葛蓬王琦(74)专利代理机构北京超凡宏宇专利代理事务所(特殊普通合伙)11463代理人陈秋梦(51)Int.Cl.A01N1/02(2006.01)权利要求书1页说明书8页(54)发明名称一种蜜蜂精子超低温冷冻保存的方法(57)摘要本发明公开了一种蜜蜂精子超低温冷冻保存的方法，涉及蜜蜂精子冷冻保存技术领域。将待保存的蜜蜂精子与稀释液混合平衡静置1～2h后，加入冷冻保护剂平衡静置1～1.5h，然后进行程序降温，所述程序降温包括以3.5‑4℃/min的速率从3～4℃下降到‑60℃～‑50℃，程序降温过程中，当温度降到‑13℃时，进行“植冰”操作，当温度下降到‑60℃～‑50℃后再降温至液氮温度。采用本发明提供的蜜蜂精子超低温冷冻保存的方法进行蜜蜂精子的保存，解冻后的精子活力高，用于人工授精时，蜂王产授精卵的比例高，保护液对授精蜂王危害小，蜂王使用寿命长。CN112931490ACN112931490A权利要求书1/1页1.一种蜜蜂精子超低温冷冻保存的方法，其特征在于，其包括如下步骤：将待保存的蜜蜂精子与稀释液混合平衡静置1～2h后，加入冷冻保护剂平衡静置1h，然后进行程序降温，所述程序降温包括以3.5～4℃/min的速率从3～4℃下降到‑60℃～‑50℃，程序降温过程中，当温度降到‑13～‑12℃时，进行“植冰”操作，当温度下降到‑60℃～‑50℃后再降温至液氮温度。2.根据权利要求1所述的蜜蜂精子超低温冷冻保存的方法，其特征在于，加入所述冷冻保护剂前的混合静置是指：将待保存的蜜蜂精子与稀释液混合，在0～4℃下平衡静置1～2h；优选地，待保存的蜜蜂精子与稀释液混合体积比例为0.5‑1:5。3.根据权利要求1或2所述的蜜蜂精子超低温冷冻保存的方法，其特征在于，将待保存的蜜蜂精子与稀释液混合后，在静置前还包括混匀步骤。4.根据权利要求3所述的蜜蜂精子超低温冷冻保存的方法，其特征在于，所述混匀步骤是先将容器置于蜜蜂精液自动混匀装置低速10～30r/min混匀10～20s，然后再调中速30～60r/min混匀10～20s。5.根据权利要求1所述的蜜蜂精子超低温冷冻保存的方法，其特征在于，所述加入冷冻保护剂静置是指：加入冷冻保护剂后，将盛有待保存蜜蜂精子的容器置于0～4℃环境温度下，使用蜜蜂精液自动混匀装置，先低速10～30r/min混匀30～35s，再调中速30～60r/min混匀30～35s，静置1～1.5h。6.根据权利要求1所述的蜜蜂精子超低温冷冻保存的方法，其特征在于，所述“植冰”操作是指：当温度降到‑13℃时，向蜜蜂精子冻存容器中滴加液氮。7.根据权利要求1所述的蜜蜂精子超低温冷冻保存的方法，其特征在于，所述稀释液包括：0.01～0.1g/mL的柠檬酸钠、0.001～0.005g/mL的碳酸氢钠、0.0001～0.001g/mL的氯化钾和水。8.根据权利要求1或7所述的蜜蜂精子超低温冷冻保存的方法，其特征在于，所述冷冻保护剂包括质量百分比为1％～3％的大豆卵磷脂、质量百分比为4％～10％二甲基亚砜、体积百分比为0.5％～2％的过氧化酶以及溶剂，优选地，所述溶剂为水。9.一种蜜蜂精子解冻方法，其特征在于，其包括将采用权利要求1‑8任一项所述的蜜蜂精子超低温冷冻保存的方法保存的蜜蜂精子进行解冻后，反复离心，取沉淀物用于蜜蜂人工授精。10.根据权利要求9所述的蜜蜂精子解冻方法，其特征在于，所述反复离心是指：将解冻后的蜜蜂精子在2000～4000rpm下离心1～5min，弃上清液，加入所述稀释液继续离心，再取沉淀用于蜜蜂人工授精。2CN112931490A说明书1/8页一种蜜蜂精子超低温冷冻保存的方法技术领域[0001]本发明涉及蜜蜂精子冷冻保存技术领域，具体而言，涉及一种蜜蜂精子超低温冷冻保存的方法。背景技术[0002]蜜蜂是一种重要的经济昆虫，可以生产多种蜂产品，同时，蜜蜂也是一种生态昆虫，蜜蜂为农作物授粉产生的生态价值远远高于蜂产品的价值。[0003]蜜蜂种质资源保护通常采用群体水平上的活体保种技术，但活体保存风险性较高，受外界因素影响较大。精子冷冻保存技术从1803年问世以来，已经在许多哺乳动物研究上取得成功，1964年Sawada和Chang首次利用7％甘油作为冷冻保护剂成功的将蜜蜂精子保存，拉开了蜜蜂精子冷冻保存的序幕。蜜蜂精子冷冻技术