一种乳铁蛋白定向免疫磁珠及其制备方法和用途.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN105842456A(43)申请公布日2016.08.10(21)申请号201510016971.X(22)申请日2015.01.14(71)申请人北京康诺生物科技有限公司地址102101北京市延庆县八达岭经济开发区康西路1629号(72)发明人张彦明柳家鹏(51)Int.Cl.G01N33/68(2006.01)G01N33/553(2006.01)G01N1/34(2006.01)权利要求书2页说明书6页序列表1页附图1页(54)发明名称一种乳铁蛋白定向免疫磁珠及其制备方法和用途(57)摘要本发明涉及一种乳铁蛋白定向免疫磁珠及其制备方法和用途，该定向免疫磁珠利用蛋白G或者蛋白A偶联到磁珠上，然后用抗乳铁蛋白的抗体与磁珠上的蛋白G或者蛋白A偶联，然后再利用交联剂对结合乳铁蛋白抗体的蛋白G/蛋白A磁珠进行交联，该免疫制备方法充分利用了蛋白G与蛋白A与抗体亲和力高以及与抗体的Fc片段特异性结合的特点。主要用于对于粮食、食品、饲料、牛奶、血样以及其他多种样本中的乳铁蛋白的结合和纯化。可以用于乳铁蛋白检测前样品前期处理，样品中乳铁蛋白检测以及乳铁蛋白纯化。CN105842456ACN105842456A权利要求书1/2页1.一种乳铁蛋白的定向免疫磁珠，其特征在于包含有磁珠载体、蛋白G或者蛋白A和乳铁蛋白抗体。2.根据权利要求1中所述的定向免疫磁珠，其特征在于蛋白G或者蛋白A通过共价键偶联在载体上，乳铁蛋白抗体与蛋白G结合，用交联剂交联，形成磁珠-蛋白G/蛋白A-乳铁蛋白抗体偶联载体。3.根据权利要求1中所述的乳铁蛋白定向免疫磁珠，其特征在于所用的蛋白G是天然的蛋白G或者基因重组表达的蛋白G。4.根据权利要求1中所述的乳铁蛋白定向免疫磁珠，其特征在于所用的蛋白A是天然的蛋白A或者基因重组表达的蛋白A。5.根据权利要求3中所述的蛋白G，包括按照序列1表达的蛋白G，以及经过序列优化后表达的蛋白G。6.根据权利要求4中所述的蛋白A，包括按照序列2表达的蛋白A，以及经过序列优化后表达的蛋白A。7.根据权利要求1中所述的载体，包括纳米磁珠以及直径超过1μm的普通磁珠。8.根据权利要求2中所述的抗乳铁蛋白抗体，其特征在于包括单克隆IgG抗体和多克隆抗体。9.一种纯化乳铁蛋白的定向免疫磁珠制备方法，其特征在于：1）将磁珠用含0.01%SDS的50mMPH6.0MES缓冲液悬起；2）在磁珠中加入EDC至终浓度5-20mg/ml，再加入Sulfo-NHS至终浓度10-25mg/ml；室温反应15-60分钟；3）反应后的磁珠用50mMMES缓冲液PH6.0洗涤3次，然后重悬在50mMPH6.0的MES缓冲液中；4）将蛋白G或者蛋白A加入重悬后的磁珠中，使蛋白量与磁珠表面配基的摩尔比达到5-10:1；5）室温反应2-4小时；6）反应后的磁珠用50mMMES缓冲液PH6.0洗涤3次；7）反应后的磁珠用1M的乙醇胺室温封闭；8）磁珠用20mMPBS缓冲液PH7.4洗涤3次，然后重悬在20mMPBSPH7.4缓冲液中；9）在磁珠中加入抗乳铁蛋白抗体，使抗体量与磁珠中蛋白G量摩尔比达到3-5:1；10）将加入抗体的磁珠在37℃反应10-40分钟；11）磁珠用0.1M硼酸缓冲液PH9.0洗涤3次，然后磁珠重悬在1MPH9.0的硼酸缓冲液中；12）将乳铁蛋白抗体—蛋白G/蛋白A—磁珠载体加入终浓度0.2M的三乙醇胺和20mM的DMP，PH8.3.室温反应1-2小时；13）用50mMPH9.0的乙醇胺终止反应，用含有0.01%硫柳汞的10mMPBSPH7.4洗涤乳14）铁蛋白抗体—蛋白G/蛋白A—磁珠3次；15）将磁珠重悬在含有0.01%硫柳汞的10mMPBSPH7.4中，放于4℃保存。10.一种乳铁蛋白的定向免疫磁珠，其用于包括粮食、饲料、牛奶及乳制品、水产、血液、尿液、水中乳铁蛋白的分离纯化，纯化后的乳铁蛋白可以用于高效液相色谱及其它方法检2CN105842456A权利要求书2/2页测。3CN105842456A说明书1/6页一种乳铁蛋白定向免疫磁珠及其制备方法和用途技术领域[0001]本发明涉及一种乳铁蛋白的定向免疫磁珠及其制备方法和用途。该定向免疫磁珠利用蛋白G或者蛋白A与磁珠共价偶联，然后将乳铁蛋白抗体连接到蛋白G或者蛋白A上，再采用交联剂进行交联，制备成稳定的乳铁蛋白定向免疫磁珠。该磁珠具有特异性强，乳铁蛋白纯化效率高和使用简便的特点。属食品药品生产和检测领域。背景技术[0002]乳铁蛋白（Lacoferrin）是一种相对分子质量约为80KD的糖蛋白，主要存在于乳中，特别在初乳中可达7g/L。不管是人乳还是牛乳，随着乳汁的成熟，其含量会有所下降。除了作为乳腺组织分泌的非特异性保护蛋