一种玉米赤霉烯酮定向免疫磁珠及其制备方法和用途.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN105842455A(43)申请公布日2016.08.10(21)申请号201510016964.X(22)申请日2015.01.14(71)申请人北京康诺生物科技有限公司地址102101北京市延庆县八达岭经济开发区康西路1629号(72)发明人张彦明柳家鹏(51)Int.Cl.G01N33/68(2006.01)G01N33/553(2006.01)G01N1/34(2006.01)权利要求书2页说明书6页序列表1页附图2页(54)发明名称一种玉米赤霉烯酮定向免疫磁珠及其制备方法和用途(57)摘要本发明涉及一种玉米赤霉烯酮定向免疫磁珠及其制备方法和用途，该定向免疫磁珠利用蛋白G或者蛋白A偶联到磁珠上，然后用抗玉米赤霉烯酮的抗体与磁珠上的蛋白G或者蛋白A偶联，然后再利用交联剂对结合玉米赤霉烯酮抗体的蛋白G/蛋白A磁珠进行交联，该免疫制备方法充分利用了蛋白G与蛋白A与抗体亲和力高以及与抗体的Fc片段特异性结合的特点。主要用于对于粮食、食品、饲料、牛奶、血样以及其他多种样本中的玉米赤霉烯酮的结合和纯化。可以用于玉米赤霉烯酮检测前样品前期处理，样品中玉米赤霉烯酮检测以及玉米赤霉烯酮纯化。CN105842455ACN105842455A权利要求书1/2页1.一种玉米赤霉烯酮的定向免疫磁珠，其特征在于包含有磁珠载体、蛋白G或者蛋白A和玉米赤霉烯酮抗体。2.根据权利要求1中所述的定向免疫磁珠，其特征在于蛋白G或者蛋白A通过共价键偶联在载体上，然后玉米赤霉烯酮抗体与蛋白G结合，然后用交联剂交联，形成磁珠-蛋白G/蛋白A-玉米赤霉烯酮抗体形式的偶联载体。3.根据权利要求1中所述的玉米赤霉烯酮定向免疫磁珠，其特征在于所用的蛋白G是天然的蛋白G或者基因重组表达的蛋白G。4.根据权利要求1中所述的玉米赤霉烯酮定向免疫磁珠，其特征在于所用的蛋白A是天然的蛋白A或者基因重组表达的蛋白A。5.根据权利要求3中所述的蛋白G，包括按照序列1表达的蛋白G，以及经过序列优化后表达的蛋白G。6.根据权利要求4中所述的蛋白A，包括按照序列2表达的蛋白A，以及经过序列优化后表达的蛋白A。7.根据权利要求1中所述的载体，包括纳米磁珠以及直径超过1μm的普通磁珠。8.根据权利要求2中所述的抗玉米赤霉烯酮抗体，其特征在于包括单克隆IgG抗体和多克隆抗体。9.一种纯化玉米赤霉烯酮的定向免疫磁珠制备方法，其特征在于：1)将磁珠用含0.01%SDS的50mMPH6.0MES缓冲液悬起；2)在磁珠中加入EDC至终浓度5-20mg/ml，再加入硫化-N-羟基琥珀酰亚胺至终浓度10-25mg/ml；3)室温反应15-60分钟；4)反应后的磁珠用50mMMES缓冲液PH6.0洗涤3次，然后重悬在50mMPH6.0的MES缓冲液中；5)将蛋白G或者蛋白A加入重悬后的磁珠中，使蛋白量与磁珠表面配基的摩尔比达到5-10:1；6)室温反应2-4小时；7)反应后的磁珠用50mMMES缓冲液PH6.0洗涤3次；8)反应后的磁珠用1M的乙醇胺室温封闭；9)磁珠用20mMPBS缓冲液PH7.4洗涤3次，然后重悬在20mMPBSPH7.4缓冲液中；10)在磁珠中加入抗玉米赤霉烯酮抗体，使抗体量与磁珠中蛋白G量摩尔比达到3-5:1；11)将加入抗体的磁珠在37℃反应10-40分钟；12)磁珠用0.1M硼酸缓冲液PH9.0洗涤3次，然后磁珠重悬在1MPH9.0的硼酸缓冲液中；13)将玉米赤霉烯酮抗体—蛋白G/蛋白A—磁珠载体加入终浓度0.2M的三乙醇胺和20mM的DMP，PH8.3.室温反应1-2小时；14)用50mMPH9.0的乙醇胺终止反应，用含有0.01%硫柳汞的10mMPBSPH7.4洗涤玉米赤霉烯酮抗体—蛋白G/蛋白A—磁珠3次；15)将磁珠重悬在含有0.01%硫柳汞的10mMPBSPH7.4中，放于4℃保存。2CN105842455A权利要求书2/2页10.一种玉米赤霉烯酮的定向免疫磁珠，其用途在于包括粮食、饲料、牛奶及乳制品、水产、血液、尿液、水中玉米赤霉烯酮的分离纯化，纯化后的玉米赤霉烯酮可以用于高效液相色谱及其它方法检测。3CN105842455A说明书1/6页一种玉米赤霉烯酮定向免疫磁珠及其制备方法和用途技术领域[0001]本发明涉及一种玉米赤霉烯酮的定向免疫磁珠及其制备方法和用途，属于玉米赤霉烯酮的纯化与检测领域。背景技术[0002]玉米赤霉烯酮(zearalenone，ZEN)又称F-2毒素，是一种2，4-二羟基苯甲酸内酯类化合物，具雌激素活性，化学名称为6-(10-羟基-6-氧基碳烯基)-β雷锁酸-μ-内酯。是由禾谷镰刀菌和黄色镰刀菌等产生的真菌毒素。它广泛存在于自然界，对动物的生长发育有着重要的作用，具有