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(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN108950069A(43)申请公布日2018.12.07(21)申请号201810813367.3(22)申请日2018.07.23(71)申请人重庆出入境检验检疫局检验检疫技术中心地址400020重庆市江北区红黄路8号(72)发明人聂福平王昱杨俊李贤良王国民李应国(74)专利代理机构重庆市恒信知识产权代理有限公司50102代理人李金蓉(51)Int.Cl.C12Q1/70(2006.01)C12Q1/6851(2018.01)C12N15/11(2006.01)C12R1/93(2006.01)权利要求书1页说明书6页序列表1页附图3页(54)发明名称牛结节性皮肤病病毒野毒株TaqMan-MGB实时荧光定量PCR检测用引物、试剂盒及检测方法(57)摘要本发明公开了一种牛结节性皮肤病病毒野毒株TaqMan-MGB实时荧光定量PCR检测用引物、试剂盒及检测方法。本方法设计获得了2条引物和一条特异的MGB探针,DNA序列分别为SEQIDNO.1~3。该试剂盒包括扩增反应液、阳性对照、阴性对照和灭菌去离子水。本发明只需要两步扩增法即可以快速、高效、特异、敏感地检测目的靶序列,且操作简便,不需要昂贵的仪器和试剂,对操作人员没有技术上的要求,检测成本低,通量高,检测周期短。CN108950069ACN108950069A权利要求书1/1页1.牛结节性皮肤病病毒野毒株TaqMan-MGB实时荧光定量PCR检测用引物及探针,其特征在于,包括:牛结节性皮肤病病毒野毒株上游引物,其DNA序列为SEQIDNO.1;牛结节性皮肤病病毒野毒株下游引物,其DNA序列为SEQIDNO.2;牛结节性皮肤病病毒野毒株MGB探针,其DNA序列为SEQIDNO.3。2.牛结节性皮肤病病毒野毒株TaqMan-MGB实时荧光定量PCR检测用试剂盒,包括扩增反应液管、阳性对照管、阴性对照管和灭菌去离子水管,其特征在于:所述扩增反应液管包括以下反应液:序列为SEQIDNO.1的10μmol/L牛结节性皮肤病病毒野毒株上游引物0.5μL;序列为SEQIDNO.2的10μmol/L牛结节性皮肤病病毒野毒株下游引物0.5μL;序列为SEQIDNO.3的10μmol/L牛结节性皮肤病病毒野毒株MGB探针1.0μL;2xpremixExTaq缓冲液8.0μL;灭菌去离子水9.0μL;19μL,为单次反应的用量;所述阳性对照管:管内为牛结节性皮肤病病毒野毒株阳性重组质粒DNA,体积为50μL;所述阴性对照管:管内为无牛结节性皮肤病病毒野毒株感染的牛组织基因组DNA,体积为50μL;所述灭菌去离子水管:1000μL。3.根据权利要求2所述牛结节性皮肤病病毒野毒株TaqMan-MGB实时荧光定量PCR检测用试剂盒,其特征在于:所述阳性重组质粒DNA按如下步骤获得:核苷酸序列为SEQIDNO.4的PCR上游引物和核苷酸序列为SEQIDNO.5的PCR下游引物按照常规方法,对人工合成牛结节性皮肤病病毒野毒株基因组进行PCR扩增,将扩增产物与pMD19-T载体进行连接,转化,测序比对获得所述阳性重组质粒DNA。4.根据权利要求2所述牛结节性皮肤病病毒野毒株TaqMan-MGB实时荧光定量PCR检测用试剂盒,其特征在于:所述DNA序列为SEQIDNO.3的牛结节性皮肤病病毒野毒株MGB探针的5’端标记有报告基团FAM,3’端标记有非淬灭基团,同时还连接有MGB修饰基团。5.利用权利要求2所述试剂盒进行牛结节性皮肤病病毒野毒株TaqMan-MGB实时荧光定量PCR检测的非疾病诊断目的的检测方法:包括如下步骤:(1)制备待测样品DNA:按照商品化病毒DNA提取试剂盒提取待测样品全基因组,制备待测样品DNA,置于-20℃备用;(2)扩增反应体系:19μL扩增反应液,1μL待检DNA模板或阳性对照或阴性对照,反应总体积为20μL;(3)荧光定量PCR扩增反应条件:95℃30s;95℃5s,56℃34s,45个循环;在56℃34s进行荧光信号的采集;(4)结果判定:将扩增反应在40个循环内且扩增曲线良好的反应直接判定为阳性,40个循环以后的直接判定为阴性,同时阳性对照的扩增曲线明显,阴性对照没有扩增;反之,阳性质控未出现目的条带或阴性对照出现条带,则结果无效。2CN108950069A说明书1/6页牛结节性皮肤病病毒野毒株TaqMan-MGB实时荧光定量PCR检测用引物、试剂盒及检测方法技术领域[0001]本发明涉及动物病毒分子生物学检测方法领域。具体涉及一种牛结节性皮肤病病毒野毒株TaqMan-MGB实时荧光定量PCR检测用引物、试剂盒及检测方法。背景技术[0002]牛结节性皮肤病(Lumpyskindisease,LSD