鉴别非洲猪瘟野毒株和基因缺失株的荧光定量检测引物及试剂盒.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN114134253A(43)申请公布日2022.03.04(21)申请号202111324516.8C12R1/93(2006.01)(22)申请日2021.11.10(71)申请人佛山科学技术学院地址528000广东省佛山市南海区狮山镇广云路33号(72)发明人陈耀曾繁聪黄淑坚马春全姜含雨辛宁柯骏鸿罗瑞谢梓民杨惠湖肖娅琪(74)专利代理机构广州嘉权专利商标事务所有限公司44205代理人朱继超(51)Int.Cl.C12Q1/70(2006.01)C12Q1/6851(2018.01)C12N15/11(2006.01)权利要求书1页说明书7页序列表1页附图2页(54)发明名称鉴别非洲猪瘟野毒株和基因缺失株的荧光定量检测引物及试剂盒(57)摘要本发明目的在于提供鉴别非洲猪瘟野毒株和基因缺失株的荧光定量检测引物及试剂盒，包括引物、探针，以及含有所述引物和探针的试剂盒。该引物、探针、试剂盒均针对I177L基因，可以建立荧光定量TaqMan探针法，检测的最低检出量为4.63×101copies/μL，灵敏度高，特异性良好，批内及批间变异系数均小于2.2％。因此本发明可以作为一种快速、灵敏、准确的检测手段应用到实际生产及疫情监测中，为将来疫苗株与野毒株感染的鉴别检测提供参考。CN114134253ACN114134253A权利要求书1/1页1.引物，其特征在于，包括如SEQIDNO.1所示的上游引物片段和如SEQIDNO.2所示的下游引物片段。2.探针，其特征在于，包括如SEQIDNO.3所示的探针片段。3.根据权利要求2所述探针，其特征在于，所述探针片段的5’端连接有荧光报告基团，所述探针片段的3’端连接有淬灭基团。4.试剂盒，其特征在于，包括如权利要求1所述的引物组合和如权利要求2或权利要求3所述的探针。5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，还包括2倍浓度的预混合Taq酶试剂。6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述2倍浓度的预混合Taq酶试剂为PremixExTaq。7.根据权利要求5或6所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的反应体系包括12.5μL的2倍浓度的预混合Taq酶试剂、8μL的ddH2O、0.5μL的上游引物片段、0.5μL的下游引物片段、1μL的探针片段。8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述上游引物片段、所述下游引物片段、所述探针片段的浓度均为10μM。9.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，还包括质粒标准品，所述质粒标准品含有如SEQIDNO.4所示的目的序列片段。10.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述反应体系的标准曲线方程为Y＝‑3.096lgX+36.18；相关系数R2＝0.998；扩增效率E＝110.37％。2CN114134253A说明书1/7页鉴别非洲猪瘟野毒株和基因缺失株的荧光定量检测引物及试剂盒技术领域[0001]本发明涉及基因检测技术领域，特别涉及鉴别非洲猪瘟野毒株和基因缺失株的荧光定量检测引物及试剂盒。背景技术[0002]非洲猪瘟病毒(ASFV)是一种线性双股DNA病毒，该病毒的粒子结构与虹彩病毒相似，大小相似，但是该病毒的基因结构以及复制方式则与虹彩病毒不同，而是有着与痘病毒相同的特点。在病毒分类上，国际病毒分类委员会先后在第四次和第五次报告中将其归类于虹彩病毒科和痘病毒科。随着分子生物学技术的发展，对非洲猪瘟病毒DNA序列分析表明，非洲猪瘟病毒虽然具有痘病毒和虹彩病毒的部分特征，但不属于国际病毒分类委员会之前所核定的任何一科，是一个全新的病毒科，因此，目前该病毒归属于非洲猪瘟病毒科(Asfarviridae)非洲猪瘟病毒属(Asfivims)，而且是其中的唯一成员，也是虫媒病毒中唯一的DNA病毒。[0003]目前，针对ASFV的检测技术主要有病毒分离、红细胞吸附试验(HAD)、ELISA、PCR和实时荧光定量PCR等。[0004]病毒分离和红细胞吸附试验均需要在生物安全3级及以上实验室进行，病毒分离还需要结合HAD或者PCR、ELISA等技术确定是否为ASFV感染。而HAD中，部分非“红细胞吸附”毒株不能用该方法进行检测。病毒分离和HAD需要花费的时间长，技术要求高，场地要求高，检测的同时需要其他检测技术辅助是否为ASFV感染。[0005]ELISA是OIE推荐的首选血清学检测方法，其大多是以具有良好抗原性的ASFV结构蛋白为包被抗原，建立的间接检测方法。该方法具有成本低、特异性好、灵敏度高和检测速度快等优势，能够用于大量样品的自动化检测，是目前应用最广泛的检测方法。但该方法与PCR相比，耗时长，结果易出现假阳性；样品保存不当，如高温或样品保存时间过久等因素均会影响检测结果