棘颚口线虫、日本颚口线虫、杜氏颚口线虫的多重PCR检测方法及检测用引物.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局*CN102363809A*(12)发明专利申请(10)申请公布号CN102363809A(43)申请公布日2012.02.29(21)申请号201110348855.X(51)Int.Cl.(22)申请日2011.11.07C12Q1/68(2006.01)C12N15/11(2006.01)(71)申请人中华人民共和国上海出入境检验检疫局地址200135上海市浦东新区民生路1208号(72)发明人李树清李雯雯张鸿满陈韶红黄维义陈志飞张子群王巧全张强王艳李健(74)专利代理机构上海浦一知识产权代理有限公司31211代理人王函权利要求书2页说明书7页序列表3页附图1页(54)发明名称棘颚口线虫、日本颚口线虫、杜氏颚口线虫的多重PCR检测方法及检测用引物(57)摘要本发明公开了一种棘颚口线虫、日本颚口线虫、杜氏颚口线虫的多重PCR检测方法，包括如下步骤：首先提取颚口线虫DNA，同时进行棘颚口线虫、日本颚口线虫、杜氏颚口线虫特异引物设计。然后，对设计的引物进行PCR反应条件的优化，确定最佳多重PCR模式。按照最佳多重PCR模式进行实验，验证各引物单一PCR特异性、多重PCR特异性、PCR敏感性和临床样本操作的可行性。此外，本发明还公开了用于同时检测棘颚口线虫、日本颚口线虫、杜氏颚口线虫的引物序列。通过各种验证表明本发明方法可以同时鉴定棘颚口线虫、日本颚口线虫、杜氏颚口线虫，其快速、敏感、特异和同步鉴定3种颚口线虫的特点可应用于水产品颚口线虫的鉴定和检疫。CN1023689ACCNN110236380902363827A权利要求书1/2页1.一种棘颚口线虫、日本颚口线虫、杜氏颚口线虫的多重PCR检测方法，其特征在于，具体步骤包括如下：①棘颚口线虫、日本颚口线虫、杜氏颚口线虫的虫体DNA提取；②引物设计与筛选；③对步骤②所设计的引物进行PCR反应条件优化，得到最佳多重PCR模式；④按照步骤③的最佳PCR反应条件进行单一PCR扩增特异性验证；⑤按照步骤③的最佳PCR反应条件进行多重PCR扩增特异性验证；⑥按照步骤③的最佳PCR反应条件进行PCR敏感性验证；⑦按照建立的多重PCR方法对临床虫种鉴定方法进行可行性验证。2.根据权利要求1所述的棘颚口线虫、日本颚口线虫、杜氏颚口线虫的多重PCR检测方法，其特征在于，步骤①中，所述的棘颚口线虫、日本颚口线虫、杜氏颚口线虫的虫体DNA提取方法为：从70％乙醇保存液中取出单个标准虫种，采用DNA提取试剂盒提取棘颚口线虫、日本颚口线虫、杜氏颚口线虫基因组DNA，将提取的基因组DNA置-20℃保存备用。3.根据权利要求1所述的棘颚口线虫、日本颚口线虫、杜氏颚口线虫的多重PCR检测方法，其特征在于，步骤②中所述的引物设计与筛选具体为：应用分子生物学软件对颚口属线虫种间的ITS2基因序列进行比对分析，选择碱基差异较大的区域，在该范围设计棘颚口线虫、日本颚口线虫、杜氏颚口线虫特异性引物，筛选确定引物，确保所设计引物必须为特异性引物，一对引物只能扩增出相应虫种的序列片段，并且与其它引物之间没有干扰，即没有同源、互补，不形成发卡结构；所述设计的引物序列为：棘颚口线虫的特异性引物：GS2-F：5’-GAGATGTCTAGCATCATCTCT-3’(SEQIDNO.1)；GS4-R：5’-ACTGTATCGGCGAAGCTG-3’(SEQIDNO.2)；杜氏颚口线虫的特异性引物：GD2-F：5’-AGATTTTGTTGCTGTTCGTT-3’(SEQIDNO.3)；GD3-R：5’-TATATACGGCCGCAGCTC-3’(SEQIDNO.4)；日本颚口线虫的特异性引物：GN1-F：5’-TCTACGACGACGAGAGGACT-3’(SEQIDNO.5)；GN5-R：5’-TGGAGTTGTCGATGTGTG-3’(SEQIDNO.6)。4.根据权利要求1所述的棘颚口线虫、日本颚口线虫、杜氏颚口线虫的多重PCR检测方法，其特征在于，步骤③中，所述的PCR反应条件优化具体方法为：选择25μL的PCR反应体系，体系包含25mmol/LMg2+2.5μL，10×PCRbuffer2.5μL，2.5mmol/LdNTP1μL，5U/μLTaq聚合酶0.1μL，DNA模板1μL，引物工作浓度为10μmol/L，根据多重PCR条带的明亮，适当调整步骤②的引物加入量的比例；退火温度根据引物Tm值范围进行51℃、53℃、55℃、57℃、59℃、61℃退火温度梯度试验，最后确定最佳的多重PCR模式。5.根据权利要求1或4所述的棘颚口线虫、日本颚口线虫、杜氏颚口线虫的多重PCR检测方法，其特征在于，步骤③的最佳多重PCR模式具体为：最佳多重PCR反应体系：25μL反应体系中10×buffer2.5