载体与目的基因的连接与转化以及重组DNA的提取与酶切鉴定.pdf

实验一载体与目的基因的连接与转化以及

重组DNA的提取与酶切鉴定

一、实验目的

1法制备感受态细胞
.CaCl2

2.目的基因与载体连接（c-myc+pSV2；粘端连接）

3.重组质粒转化大肠杆菌并筛选转化体（HB101；Ampr）

4.质粒DNA的小量快速制备

5.质粒DNA的限制性内切酶酶切

6.DNA的琼脂糖凝胶电泳

二、实验原理

通过粘端连接法将具有相同粘性末端的DNA分子连接在一起，通过碱基配对
氢键形成一个相对稳定的结构，利用连接酶发挥间断修复的功能，从而获得重组

的DNA分子。
受体细胞经处理后（电击或等处理），细胞膜通透性发生变化，从而使
CaCl2
外源的载体分子通过感受态细胞，并使受体细胞获得新的稳定遗传的性状，该过程

称为转化。由于本实验种pSV带有抗氨苄青霉素的基因，因而转化后的细胞在含
氨苄青霉素的平板上培养可以筛选出转化成功的受体细胞。

分离质粒DNA的步骤包括：培养细菌使质粒扩增、收集和裂解细菌以及分离

和纯化质粒DNA。SDS可以使细胞壁裂解，碱变性抽提质粒DNA的原理是利用

染色体DNA与质粒DNA的变性复性的差异达到分离目的，当pH>12.6时，染色体

DNA氢键断裂，双螺旋结构解开而变性，质粒DNA由于超螺旋共价闭合环状结

构，两条互补链不会完全分离。当采用pH4.8的NaAc高盐缓冲液调节pH至中性

时，质粒DNA恢复原有的构型，而染色体DNA则不能复性而缠绕形成网状结构。

通过离心可将染色体DNA及大分子RNA、蛋白质等去除。
三、实验器材和试剂

1.器材
恒温摇床、电热恒温培养箱、电热恒温水浴、台式离心机、低温离心机、涡旋

振荡器、移液枪及枪头、1.5ml离心管、制冰机、三角推棒、酒精灯、细菌培养管、
电泳槽及电泳仪、凝胶成像系统等。。

2.试剂

1)用BamHI和XbaI处理的线状pSV质粒DNA(20ng/ul)

2)用BamHI和XbaI处理的4.8kbc-mycDNA片段(20ng/ul)

3)已连接好c-myc目的片段的pSV重组质粒DNA(5ng/ul)

4)T4DNA连接酶(5U/ul)及10X连接酶缓冲液(Thermo公司)

5)LB培养基以及含琼脂的LB培养基铺制的平板(含抗生素)

6)0.1mol/LCaCl/溶液

7)AxyPrep质粒DNA小量试剂盒(Axygen公司产品)

8)无水乙醇

9)BamHI(10ug/ul)及XbalI(10ug/ul)(NEB公司产品)

10)10XBuffer4(NEB公司产品)

11)1XTAE(0.04mol/LTris-乙酸；0.001mol/LEDTA)

12)YDNAHindIIIMarkers(0.1ug/ul)(Thermo公司)

13)6X凝胶加样缓冲液(0.25%溴酚蓝；40%(w/v)蔗糖水溶液)

14)氨苄青霉素储存液(100mg/ml)

15)CelRed核酸染料(10000Xinwater)(Biotium公司产品)四、实验步骤

1.目的基因c-myc与pSV质粒载体的连接

目的基因片段(4.8kb)，25ng/ul4ul

载体DNA(3.5kb),25ng/ul4ul

10Xbuffer1ul

T4DNA连接酶(5U/ul)0.5ul

ddH2O0.5ul
总体积：10ul

混匀，16℃水浴锅温浴

2.CaCl法制备感受态细胞
2
1)取0.1ml大肠杆菌HB101培养物，加至3mlLB培养液中，37℃振摇约

2h,细胞长至云雾状。
2）将细胞悬液倒入15ml离心管，冰浴10min。

3）4℃,4000rpm,离心10min。

4）去上清，在纸巾上倒置1min。
5）沉淀重悬于冰预冷的（）,混匀。
1mlCaCl20.1mol/L
6）转入1.5ml离心管，冰浴10min。

7）4℃，4000rpm,离心10min。

8）去上清，在纸巾上倒置1min，重悬于120ulCaCl2（0.1mol/L），分装为50
ul/管。
3.重组质粒转化感受态细胞

1）5ul连接产物或阳性对照1ul分别加入50ul感受态细胞，冰浴30min。

2）42℃，90sec。

3）立即冰浴1~2min。

4）分别加入LB培养液150ul，37℃振摇45min。

5）分别取200ul实验组和100ul对照组铺板于含Amp的LB平板。
6）37℃温箱培养过夜。

4.重组质粒的提取

1）将细菌培养物全部倒入15ml离心管，4500rpm，5min，去上清，沥干。

2）加入250ulBufferS1，吹打混匀以充分悬浮细胞，转入1.5ml离心管。

3）加入250ulBufferS2,上下颠倒，温和混匀4~6次