XXXX年本科实验四 重组质粒DNA提取、双酶切鉴定.ppt

质粒DNA的制备限制性内切酶切割重组质粒基因克隆基因工程基因克隆示意图基因载体
基因工程中常用的载体(vector)主要包括质粒(plasmid)、噬菌体(phage)和病毒(virus)柯斯质粒。这些载体均需经人工构建，除去致病基因，并赋予一些新的功能，如有利于进行筛选的标志基因、单一的限制酶切点等。实验内容实验目的一.质粒DNA的提取1.1质粒的定义
质粒是细菌细胞内一种自我复制的环状双链DNA分子，能稳定地独立存在于染色体外，并传递到子代，一般不整合到宿主染色体上。
在细胞内它们常以共价闭环的超螺旋形式存在。
(2)开环DNA(opencircularDNA,OCDNA)
如果两条链中有一条的一处或多处断裂，分子就能发生旋转而消除链的张力，形成松弛型的环状分子。(3)线状DNA(linearDNA,LDNA):
如果两条链均断开，即为线状DNA。

电泳时，三者泳动速度大小关系（？？？）

最快1.3质粒DNA的基本特征：
(1)自主复制性：能独立于染色体DNA外自主复制；
(2)可扩增性：严紧型复制-复制1-5个拷贝
松弛型复制-复制数十个拷贝；
(3)可转移性：通过细菌结合作用从一个宿主细胞转移到另一个宿主细胞；
(4)不相容性：具有相似复制子结构特征的两种不同质粒不能稳定地存在于同一受体细胞内。

1.4理想的克隆载体：
(1)分子质量小、多拷贝、松弛控制型；
(2)具有多种常用的限制酶的单切点；
(3)能插入较大的外源DNA片段；
(4)具有容易操作的检测表型。

1.4提取质粒DNA的目的与意义：

基因载体/基因克隆/基因工程2.1提取质粒DNA的常规方法

(1)SDS碱裂解法
(2)煮沸法
(3)highpureplasmidisolationkit等。
但原理相似，都是利用宿主染色体DNA和质粒DNA的差异来分离的：
★宿主菌染色体DNA通常比质粒DNA要大得多
★纯化分离的宿主菌DNA多为线性分子，而质粒
DNA呈闭合环的形式。
2.2分离纯化质粒DNA的主要步骤2.3核酸分离纯化的总原则：3.SDS-碱裂解法提取Puc119-U6重组质粒DNA
3.1实验原理：3.2主要试剂及作用溶液II：由SDS（十二烷基硫酸钠）与NaOH组成(裂解、变性)
①SDS的作用是解聚核蛋白并与蛋白质分子结合使之
变性（裂解细胞和蛋白质变性作用）
②NaOH（PH>12）的作用是破坏氢键，使DNA分子变性（DNA变性作用）
溶液III：HAC(乙酸)和KAC(乙酸钾)组成的高盐溶液
(复性，分离)
①HAC溶液能中和溶液Ⅱ的碱性，使染色体DNA
变性而发生缠绕，并使质粒DNA复性。
②KAC会与SDS形成溶解度很低的盐，并与蛋白质形成
沉淀而除去；溶液中的DNA也会与蛋白质-SDS
复合物缠绕成大分子而与小分子质粒DNA分离。3.3实验步骤注意事项：
1、加样枪正确使用；
2、标记自己所提取的质粒类型；
3、废液倒在水池中，枪头扔到垃圾桶中；
4、加不同溶液要换枪头；
5、离心前把管擦干；
6、转移上清时不要吸到沉淀；
7、吸取酚时枪头伸到下层溶液中，注意不要沾到
皮肤；
8、每人最终得到20ul质粒DNA，其中10ul用于酶
切和电泳，其余DNA储存于-20℃用于电泳对
照！
二、限制性内切酶切割重组质粒1.3作用
与甲基化酶共同构成细菌的限制修饰系统，限制外源DNA，保护自身DNA。第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；
第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写；
第四个字母代表株；
用罗马数字表示发现的先后次序。2BamHI、HindⅢ酶切质粒及鉴定2.2实验材料:
(1)重组质粒;
(2)BamHI、HindⅢ限制性内切酶;
(3)反应缓冲液。2.3实验步骤
(1)建立反应体系
(2)酶切反应（温育12h）
(3)电泳鉴定（下次实验课内容）2.4双酶切体系

质粒DNA10μl
10×Mbuffer2μl
BamHⅠ1μl
HindⅢ1μl
ddH2O6μl

思考题？Thankyou！