【精选】质粒的提取和鉴定,DNA酶切.ppt

碱变性法小量提取质粒DNA的限制性酶切实验目的质粒(plasmid)分离质粒DNA的基本步骤质粒DNA的提取方法碱变性（裂解）法基本原理：原理示意图质粒DNA电泳溴化乙锭（EB）是一种荧光染料(38-二氨基-5-乙基-6苯基菲啶溴盐)其分子可以嵌入到核酸的碱基对之间在紫外线的激发下发出橙色荧光Attentionplease!质粒提取实验材料与试剂溶液Ⅰ—溶菌液：50mM葡萄糖25mMTris.Cl（pH8.0）10mMEDTA2mg/ml溶菌酶。溶液Ⅱ—NaOH-SDS液：0.2NNaOH1%SDS。溶液Ⅲ—3mol/LNaAc（pH4.8）溶液：5MKAC10ml冰醋酸11.5ml水28.5ml。步骤一细菌培养与质粒扩增步骤二质粒提取5.加入150μL溶液III（冰上预冷）盖紧管口颠倒数次使混匀冰上放置5min。6.12000rpm4℃离心5min将上清夜转至另一1.5mlEppendorf管中。7.加入等体积酚/氯仿（1：1）振荡混匀室温放置5-10min12000rpm4℃下离心2分钟倒去上清把Eppendorf管倒扣在吸水纸上吸干液体。8.加入2倍体积冰预冷无水乙醇振荡混匀12000rpm4℃离心5分钟。9.倒去上清加入1ml冰预冷70%乙醇振荡漂洗DNA沉淀。12000rpm4℃离心2分钟。10．弃上清并尽量吸除液体打开管盖室温放置5min。室温放置15min干燥。11．50µlTE缓冲液(含无DNase的RNase20µg/ml)使DNA完全溶解（-20℃保存）12．取样品10µl加2ul6×Loadingbuffer于1%琼脂糖电泳电泳凝胶在凝胶成像系统上成像。MpBSKpGFP菌体老化碱裂解不充分菌体中无质粒溶液使用不当混有蛋白混有RNA混有基因组DNA提高质粒产量的注意事项DNA的限制性酶切Plasmid(质粒)Polylinker(多克隆位点）SequenceMapRestrictionmap限制性核酸内切酶:一类能识别双链DNA中特定碱基顺序的核酸水解酶。限制性切酶以内切的方式水解核酸链中的磷酸二酯键产生的DNA片段5’端带磷酸基团3’端为-OH。限制性核酸内切酶分类EcoRIⅡ型限制与修饰系统酶切反应中应注意以下几个问题：5.DNA：作为内切酶的底物DNA应该具备一定的纯度其溶液中不能含酚、氯仿、乙醚、SDS和酒精等这些因素的存在均在不同程度影响限制性内切酶的活性。反应缓冲液：2.酶解的温度：大多数限制酶的反应时间为37℃如EcoRⅠ、HindⅢ、BamHⅠ、PstⅠ等也有如BclⅠ需在50℃下进行反应。3.酶解反应时间：根据酶的单位与DNA用量之比来定原则是酶/DNA＝2~312小时即可充分酶解。4.酶单位定义：在每种内切酶理想的反应条件下0.05mL反应混合物中1小时消化1μg底物DNA的酶量为1单位(1U)。双酶切实验材料方法和步骤2.将反应体系充分混匀并于台式离心机上短暂离心收集液体。3.Eppendorf管于37℃水浴中反应1.5小时。4.反应结束后70℃灭活15min或者加入EDTA至终浓度10mM终止反应。5.取20µl反应液加入6×loadingbuffer混匀于1.2％琼脂糖凝胶胶上150伏电泳约30min。加入5µl未酶切对照。6.凝胶成像体系观察记录结果。7.当DNA条带充分分开后在紫外灯下细心切取所要的DNA条带。尽量去除多余的凝胶。紫外灯照射DNA片段不要超过30秒。注意保护眼睛免受紫外线伤害。实验结果凝胶成像结果1234567891011121312345678910111213思考题5.在整个酶切反应过程中应注意哪些问题？6.如何选择DNA和限制性内切酶的用量？7.反应体系中为何内切酶用量不能超过整个反应体系的10%？