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免疫荧光技术（Immunofluorescencetechnique）

荧光抗体技术：以荧光物质标记抗体而进行抗原定位的技术称为荧光抗体技术（Fluorescent
antibodytechnique）。

用荧光抗体示踪或检查相应抗原的方法称荧光抗体法；用已知的荧光抗原标记物示踪或检查相
应抗体的方法称荧光抗原法。这两种方法总称免疫荧光技术，因为荧光色素不但能与抗体球蛋
白结合，用于检测或定位各种抗原，也可以与其他蛋白质结合，用于检测或定位抗体，但是在
实际工作中荧光抗原技术很少应用，所以人们习惯称为荧光抗体技术，或称为免疫荧光技术。
以荧光抗体方法较常用。用免疫荧光技术显示和检查细胞或组织内抗原或半抗原物质等方法称
为免疫荧光细胞（或组织）化学技术。

直接法：

用抗原多次免疫动物，产生抗体，从血清中分离抗体，与荧光色素结合，制备荧光抗体溶液，
浸染标本，直接定位标本内的抗原或抗体成分

间接法：

用动物或人免疫球蛋白（IgG）作抗原，免疫动物，产生抗免疫球蛋白抗体（抗抗体）与荧光色
素结合，制成抗免疫球蛋白荧光抗体（荧光标记的抗体Ⅱ）

一、荧光抗体的制备

（一）抗原（免疫原）

1微生物抗原：原虫、真菌、细菌、立产克体和病毒等

2组织抗原：人或动物组织内某些成分（如血浆蛋白、细胞内各种酶、激素等）

3免疫球蛋白（Ig）抗原：家兔、马和人的免疫球蛋白。有种属特异性

家兔和马的免疫球蛋白有4类：IgG、IgM、IgA、IgE

人类免疫球蛋白有5类：IgG、IgM、IgA、IgD、IgE

（二）制备免疫血清

效价高和特异性强，荧光抗体沉积在抗原上的沉淀层厚，荧光强，与抗原反应快，结合紧密，
增加敏感性

1高效价免疫血清制备的条件：

抗原要纯，课题合适。砂少，不能有效刺激机体产生抗体；太多，抑制抗体生成

动物主要为羊、马、家兔和猴等。制备抗人免疫球蛋白抗血清必须健康、反应良好，且能提供
足量血清的雄性动物，多用家兔和山羊。体重合乎要求，3公斤左右。注意营养和卫生管理。免
疫注射一月后无良好的抗体反应，或在规定注射过程后效价不高，可再注射1~2次，反应仍不佳
者，弃去

免疫途径：静脉、腹腔、皮内、皮下和淋巴结内注射。多途径免疫，一次不超过两种。其选择
决定于抗原的生物学特性和理化特性，如激素、酶和毒素等生物活性抗原，不宜静脉注射

注射次数：未免疫动物一次注射，抗体生成慢，效价低，持续时间长，特异性高；再次注射出
现再次反应，效价上升快，持续时间长，间隔一定时间，多次注射可获得训效价免疫血清，但
抗体特异性降低

抗原注射间隔时间：间隔太短，起不到再次反应的效果；太长，免疫持久，影响血清特异性一
般1~2周。以抗原性质和抗体反应而定

佐剂：有些抗原，如可溶性蛋白质抗原，在高度纯化时抗原性降低，尤其是IgM、IgA、补体和
酶知，只能得到较少的量。必须用一定的免疫佐剂，提高动物的免疫反应性，增强抗体的合成

常用Freund佐剂：羊毛脂1份，医用液体石蜡1份，卡介苗3~4毫克/毫升佐剂

加热充分混合，分装于小青霉素瓶内，10磅8分钟高压灭菌备用。用前取适量卡介苗研磨后，再
加一定量不完全佐剂（液体石蜡和羊毛脂）研磨，最后加抗原研磨至乳状液

2测定抗体和抗体效价

最后一次免疫后10~14天，由家兔耳静脉取血2~3毫升，测定抗体效价
常用环状沉淀试验：

材料：

待查血清；抗原；小试管和试管架；环状沉淀管（直径0.4毫米，长40毫米）及试管架；毛细滴
管；刻度吸管；生理盐水

方法：

取血清试管5支，置试管架上，每管加生理盐水0.9毫升，混匀，再吸0.1毫升，移入第三管中。
连续稀释抗原。最后各管抗原稀释倍数分别为1：10，1：100，1：1000，1：10000，1：
100000

用毛细吸管吸取待检血清，置入一系列环状沉淀管的管底，高度约1厘米，勿发生气泡和沾污血
液面以上的管壁等

用毛细吸管吸取已稀释的抗原，由稀释倍数最高的管开始，分别沿管壁慢慢加入各沉淀管中，
使两液面相连，不使其相混合其间发生气泡，加入的抗原量和血清量相等

室温下静置15~30分钟，观察结果：两液面间有白色环状沉淀物为阳性。发生清洗液环的抗原最
高稀释倍数为该抗体的效价。可用双向琼脂扩散及其它免疫学方法测定抗体效价

如抗体超过1：100000,由动物心脏穿刺取血，置无菌瓶或大玻璃皿中，室温下静置1~2小时，
冰箱过夜，使血清充分析出。如效价低，再加强免疫一次

（三）提取免疫球蛋白

中性饱和硫酸铵沉淀法

材料：

免疫血清；生理盐水；磷酸盐缓冲液；1%氯化钡或Nessler批示剂；饱和硫酸铵溶液；烧杯250
毫升和500毫升；玻棒；离心机（大管）；透析袋

磷酸盐缓冲液（PBS，pH7.4):氯化钠6克，