免疫荧光技术（immunofluorescencetechnique）又称荧光抗体技术.pdf

免疫荧光技术

免疫荧光技术（immunofluorescencetechnique）又称荧光抗体技术。始
创于40年代初，1942年coons等多次报道用异氰酸荧光素标记抗体。它是在免
疫学、生物化学和显微镜技术的基础上建立起来的一项技术。免疫荧光技术包括
荧光抗体技术和荧光抗原技术，因为荧光色素不但能与抗体球蛋白结合，用于检
测或定位各种抗原，也可以与其他蛋白质结合，用于检测或定位抗体，但是在实
际工作中荧光抗原技术很少应用，所以人们习惯称为荧光抗体技术，或称为免疫
荧光技术。
该技术的主要特点是：特异性强、敏感性高、速度快。主要缺点是：非特异
性染色问题尚未完全解决，结果判定的客观性不足，技术程序也还比较复杂。
一、实验的基本原理
免疫学的基本反应是抗原-抗体反应。由于抗原抗体反应具有高度的特
异性，所以当抗原抗体发生反应时，只要知道其中的一个因素，就可以查出另一
个因素。免疫荧光技术就是将不影响抗原抗体活性的荧光色素标记在抗体（或抗
原）上，与其相应的抗原（或抗体）结合后，在荧光显微镜下呈现一种特异性荧
光反应。
二、实验方法
1、直接法
这是荧光抗体技术最简单和基本的方法。滴加荧光抗体于待检标本片上，经
反应和洗涤后在荧光显微镜下观察。标本中如有相应抗原存在，即与荧光抗体特
异结合，在镜下可见有荧光的抗原抗体复合物。此法的优点是简单、特异。但其
缺点是检查每种抗原均需制备相应的特异性荧光抗体，且敏感性低于间接法。

图一、直接免疫荧光法原理示意图

2、间接法
根据抗球蛋白试验的原理，用荧光素标记抗球蛋白抗体(简称标记抗抗体)
的方法。检测过程分为两步：第一次，将待测抗体(第一抗体)加在含有已知抗原
的标本片上作用一定时间，洗去未结合的抗体。第二，滴加标记抗抗体。如果第
一步中的抗原抗体已发生结合，此时加入的标记抗抗体就和已固定在抗原上的抗
体(一抗)分子结合，形成抗原-抗体-标记抗抗体复合物，并显示特异荧光。此法
的优点是敏感性高于直接法，而且无需制备一种荧光素标记的抗球蛋白抗体，就
可用于检测同种动物的多种抗原抗体系统。亦可用荧光素标记葡萄球菌a蛋白。
代替标记抗球蛋白抗体用于间接法荧光染色，且不受第一抗体来源的种属限制，
但敏感性低于标记抗抗体法。间接法有时易产生非特异性荧光，为其缺点。此法
常用于各种自身抗体的检测。如果第一抗体为已知，间接法也可用于鉴定未知抗
原。

图二、间接免疫荧光法原理示意图
由于免疫球蛋白有种属特异性，因此标记的抗球蛋白抗体必须用第一抗体同
种的动物血清球蛋白免疫其他动物来制备。

细胞抗原

特异性抗体

FITC

FITC标记的第二抗体

FITC

间接染色法的优点是既能检查未知抗原，也能检查未知抗体；用一种标记的
抗球蛋白抗体，能与在种属上相同的所有动物的抗体结合，检查各种未知抗原或
抗体，敏感性高。缺点是：由于参加反应的因素较多，受干扰的可能性也较大，
判定结果有时较难，操作繁琐，对照较多，时间长。间接法应设阴、阳性标本对
照，还应设有中间层对照（即中间层加阴性血清代替阳性血清）。
3.抗补体染色法
抗补体染色法简称补体法，是间接染色法的一种改良法，首先由
Goldwasser等建立。本法利用补体结合反应的原理，用荧光素标记抗补体抗体，
鉴定未知抗原或未知抗体（待检血清）。染色程序也分二步：先将未标记的抗体
和补体加在抗原标本上，使其发生反应，水洗，然后再加标记的抗补体抗体。如
果第一步中抗原抗体发生反应，形成复合物，则补体便被抗原抗体复合物结合，
第二步加入的荧光素标记的抗补体抗体便与补体发生特异性反应，使之形成抗原
-抗体-补体-抗补体抗体复合物，发出荧光。
抗补体染色法具有和间接法相同的优点，此外，还有其独特的优点：即只需
要一种标记抗补体抗体，便能检测各种抗原-抗体系统。因为补体的作用没有特
异性，它可以与任何哺乳动物的抗原-抗体系统发生反应。它的缺点是参与反应
的成分多，染色程序较复杂，比较麻烦。
除上述三种方法外，还有在此基础上演变出的一些方法，如双层法、夹心法、
混合法、三层法、抗体-抗补体法等等。
三、荧光抗体的制备
1.免疫血清的制备及免疫球蛋白的提纯
制备高效价的特异性抗血清是免疫荧光技术成功的前提。为此，用于免疫的
抗原必须高度提纯，尽可能不含其他非特异性的抗抗原物质，血清的效价与特异
性是矛盾的，通常以高效价的免疫血清为好，因为用这种血清制备荧光抗体，即
使其中含有少量非特异抗体，也可以通过稀释法将其除去。为提高血清效价，在
制备免疫原时，通常采用大剂量加佐剂，长程免疫，其中以弗氏不完全佐剂最常
用。即按抗原1份，无水羊毛脂1份，液体石蜡2份混合，待充分乳化后，免疫
动物，即可能获得高效价的免疫血清。用于荧光素标记的免疫血清