免疫荧光技术.pdf

免疫荧光双标技术中操作要点和注意事项
一、免疫荧光技术中标本制作的基本程序近似于酶免疫组化，不同点如下：
1、免疫荧光不需要使用双氧水处理，封闭和一抗孵育与其相同。
2、免疫荧光的二抗使用不同荧光标记的二抗孵育，孵育时间根据抗体的工作浓度确定。
3、二抗孵育之后充分洗片后即可贴片、封片和观察。
4、免疫荧光在封片时常使用专用封片剂或甘油：0.01MPBS（1：1）。条件许可，建议购
买抗淬灭的封片液，使标本可以保存更久。
5、荧光抗体的孵育以及后续处理需要避光。
6、荧光抗体染色假阳性可能会多，需要分别设定阳性和阴性对照。
二、注意事项
1、荧光染色后一般在1h内完成观察，或于4℃保存4h，时间过长，可能会使荧光提前衰退。
2、每次试验均需设置以下三种对照：
（1）阳性对照：阳性血清+荧光标记物；
（2）阴性对照：阴性血清+荧光标记物；
（3）荧光标记物对照：PBS+荧光标记物。
三、免疫荧光双标的经验之谈
1、选取一抗时，要求来源于两种不同的动物，我用的是来源于家兔和大鼠的抗体，二抗则
是不同荧光信号标记的，我用的是donkeyanti-rabbit-FITC（绿）和donkeyanti-rat-Tex-Red
（红）。
2、我的做法是两种一抗同时孵育，然后两种二抗同时孵育。抗体浓度、孵育时间要自我摸
索，我感觉一抗4℃孵育过夜比较好，背景比较清晰。
3、我的阳性对照采用的是阳性组织切片，阴性对照则分别是家兔和大鼠的IgG，荧光标记
物对照是PBS+荧光标记物。
4、封闭血清是二抗来源动物的正常血清，我用的是10%正常donkey血清。
5、其余事项同免疫荧光单标操作。
免疫荧光的标本制作的基本程序同DAB显色的免疫组化：
不同的是
1免疫荧光不需要使用双氧水处理，封闭和一抗孵育与其它相同
2免疫荧光的二抗使用不同荧光标记的二抗孵育，孵育时间根据抗体的工作浓度确定
3二抗孵育之后充分洗片后即可贴片、封片和观察
4、免疫荧光在封片使用专用封片剂或甘油：0.01MPBS（1：1）
5条件许可可以购买防淬灭的试剂加入封片剂中，标本可以保存更久
6荧光抗体的孵育以及后续处理需要闭光
87荧光抗体染色假阳性可能会多，需要设定阳性和阴性对照

注意事项
1.荧光染色后一般在1h内完成观察，或于4℃保存4h，时间过长，会使荧光减弱。

2.每次试验时，需设置以下三种对照：

（1）阳性对照：阳性血清+荧光标记物

（2）阴性对照：阴性血清+荧光标记物

（3）荧光标记物对照：PBS+荧光标记物

1、问：用免疫荧光方法做组织切片和培养细胞内的蛋白，两者操作过程有哪些不同？

参考见解：只是固定方法不同。细胞固定用甲醇，切片固定用多聚甲醛，而染色方法是一样的。

2、问：近期要做免疫荧光双标，不知哪位有免疫荧光双标技术的详细步骤及其注意事项？

参考见解：我正在做冰冻组织切片的免疫荧光双染。我的经验是：

（1）选取一抗时要来源于两种不同的动物，我用的是来源于rabbit和rat的抗体，二抗则是不同荧光信号标记的，我用的是don

keyanti-rabbit-FITC（绿）和donkeyanti-rat-Tex-Red（红）。

（2）我的做法是两种一抗同时孵育，然后两种二抗同时孵育。抗体浓度、孵育时间要仔细摸索，我感觉一抗4度孵育过夜比较

好，背景比较清晰。

（3）我的阳性对照用的是阳性组织切片，阴性对照则分别是家兔和大鼠的IgG，荧光标记物对照是PBS+荧光标记物。

（4）封闭血清与二抗来源动物一致，我用的是10%的正常donkey血清。

（5）其余步骤同一般免疫荧光单标操作。

3、问：本人拟做Brdu标记神经干细胞免疫荧光，二抗为FITC标记，想请教各位大侠：

（1）抗体分装和荧光显微镜观察时是否一定要在暗室中进行？

（2）封片时是否用甘油缓冲液即可，还是用甘油和0.5mmol/LpH9.0-9.5的碳酸氢盐缓冲液等量混合封片？

（3）免疫酶染色中的3%过氧化氢及2N盐酸是否还需要用？

参考见解：

（1）你的二抗是用FITC标记的，为避免荧光分解，分装及荧光显微镜观察时均要避光；

（2）封片最好用甘油加0.5mmol/LpH9.0-9.5的碳酸氢盐缓冲液，后者能使玻片透明；
（3）关于免疫酶染色，如果是用过氧化物酶做标记，就必须用以去除内源性过氧化物酶；盐酸需要使用，目的是使
3%H2O22N

DNA变性，让Brdu抗体能够充分地与已经掺入的Brdu结合。

4、问：做间接法免疫荧光染色，如何设置对照？

参考见解：最好是同一视野在未用荧光激发下进行对照，看是否非特异性染色。

（1）空白对照：如果你做的是石蜡切片免疫组化，这个对照必须有，目的是看自发荧光，脱蜡后直