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免疫荧光技术

荧光免疫技术是标记免疫技术中发展最早的一种。很早以来就有一些学者试图将抗体分

子与一些示踪物质结合，利用抗原抗体反应进行组织或细胞内抗原物质的定位。Coons等于

1941年首次采用荧光素进行标记而获得成功。这种以荧光物质标记抗体而进行抗原定位的

技术称为荧光抗体技术（fluorescentantibodytechnique）。

荧光免疫法按反应体系及定量方法不同，还可进一步分做若干种。与放射免疫法相比，

荧光免疫法无放射性污染，并且大多操作简便，便于推广。国外生产的TDM用试剂盒，有

相当一部分即属于此类，并且还有专供TDM荧光偏振免疫分析用的自动分析仪生产。

由于一般荧光测定中的本底较高等问题，荧光免疫技术用于定量测定有一定困难。近年

来发展了几种特殊的荧光免疫测定，与酶免疫测定和放射免疫分析一样，在临床检验中应用。

有关荧光的基本知识

一、荧光现象

（一）荧光的产生

一此化学物质能从外界吸收并储存能量（如光能、化学能等）而进入激发态，当其从激

发态再回复到基态时，过剩的能量可以电磁辐射的形式放射（即发光）。

荧光发射的特点是：可产生荧光的分子或原子在接受能量后即刻引起发光；而一旦停止

供能，发光（荧光）现象也随之在瞬间内消失。

可以引起发荧光的能量种类很多，由光激发所引起的荧光称为致荧光。由化学应所引起

的称为化学荧光，由X线或阴极射线引起的分别称为X线荧光或阴极射线荧光。荧光免疫

技术一般应用致荧光物质进行标记。

（二）荧光效率

荧光分子不会将全部吸收的光能都转变成荧光，总或多或少地以其他形式释放。荧光效

率是指荧光分子将吸收的光能转变成荧光的百分率，与发射荧光光量子的数值成正比。

荧光效率＝发射荧光的光量分子数（荧光强度）／吸收光的光量子数（激发光强度）

发射荧光的光量子数亦即荧光强度，除受激发光强度影响外，也与激发光的波长有关。

各个荧光分子有其特定的吸收光谱和发射光谱（荧光光谱），即在某一特定波长处有最大吸

收峰和最大发射峰。选择激发光波长量接近于荧光分子的最大吸收峰波长，且测定光波量接

近于最大发射光波峰时，得到的荧光强度也最大。

（三）荧光的猝灭
荧光分子的辐射能力在受到激发光较长时间的照射后会减弱甚至猝灭，这是由于激发态

分子的电子不能回复到基态，所吸收的能量无法以荧光的形式发射。一些化合物有天然的荧

光猝灭作用而被用作猝灭剂，以消除不需用的荧光。因此荧光物质的保存应注意避免光（特

别是紫外光）的直接照射和与其他化合物的接触。在荧光抗体技术中常用一些非荧的色素物

质如亚甲蓝、碱性复红。伊文思蓝或低浓度的过锰酸钾、碘溶液等对标本进行得当复染，以

减弱非特异性荧光本质，使特异荧光更突出显示。

二、荧光物质

（一）荧光色素

许多物质都可产生荧光现象，但并非都可用作荧光色素。只有那些能产生明显的荧光并

能作为染料使用的有机化合物才能称为免疫荧光色素或荧光染料。常用的荧光色素有：

1．异硫氰酸荧光素（fluoresceinisothiocyanate，FITC）为黄色或橙黄色结晶粉末，易溶

于水或酒精等溶剂。分子量为389.4，最大吸收光波长为490495nm，最大发射光波长

520530nm，呈现明亮的黄绿色荧光，结构式如下：

有两种同分异结构，其中异构体Ⅰ型在效率、稳定性、与蛋白质结合能力等方面都更好，

在冷暗干燥处可保存多年，是应用最广泛的荧光素。其主要优点是：①人眼对黄绿色较为敏

感，②通常切片标本中的绿色荧光少于红色。

2．四乙基罗丹明（rhodamine，RIB200）为橘红色粉末，不溶于水，易溶于酒精和丙酮。

性质稳定，可长期保存。结构式如下：

最大吸收光波长为570nm，最大发射光波长为595～600nm，呈橘红色荧光。

3．四甲基异硫氰酸罗丹明（tetramethylrhodamineisothiocyanate，TRITC）结构式如下：

最大吸引光波长为550nm，最大发射光波长为620nm，呈橙红色荧光。与FITC的翠绿

色荧光对比鲜明，可配合用于双重标记或对比染色。其异硫氰基可与蛋白质结合，但荧光效

率较低。

（二）其他荧光物质

1．酶作用后产生荧光的物质某些化合物本身无荧光效应，一旦经酶作用便形成具有强

荧光的物质。例如4-甲基伞酮-β-D半乳糖苷受β-半乳糖苷酶的作用分解成4-甲基伞酮，后

者可发出荧光，激发光波长为360nm，发射光波长为450nm。其他如碱性酸酶的底物4-甲

基伞酮磷酸盐和辣根过氧化物酶的底物对羟基苯乙酸等。
2．镧系螯合物某些3价稀土镧系元素如铕（Eu3+）、铽（Tb3+）、铈（Ce3+）等的螯

合物经激发后也可发射特征性的荧光，其中以