免疫荧光技术.ppt

免疫荧光技术一、一些基本概念和基本知识：

1荧光免疫测定技术的概念：将试剂抗原或试剂抗体用荧光素进行标记，试剂与标本中相应的抗体或抗原反应后，测定复合物中的荧光素，这种免疫技术，称为免疫荧光素技术。2.技术分类：
⑴荧光抗体技术(荧光显微镜技术)
抗原抗体反应后，利用荧光显微镜判
定结果的检测方法。

⑵免疫荧光测定技术：
抗原抗体反应后，利用特殊仪器测定
荧光强度而推算被测物浓度的检测方法荧光的产生：
物质吸收外界能量而进入激发状态，在回复基态时多余的能量以电磁辐射的形式释放，即发光，这种光称为荧光。
这种物质，称为荧光素
由光激发所引起的荧光，为光致荧光
------荧光免疫技术
由化学反应所引起的荧光，为化学荧光
------化学发光技术荧光素的荧光特性：

⑴停止供能，荧光现象随即终止
⑵对光的吸收和荧光的发射具高度选择性
入射光波长<发射光波长
⑶荧光效率：发射荧光的光量子数
荧光效率=
吸收光的光量子数
⑷荧光猝灭现象：荧光素的辐射能力减弱5常见荧光素：

⑴FITC
⑵RB200
⑶TRITC
⑷镧系：Eu、Tb
⑸PE
⑹其它常见荧光素的特性：
⑴FITC：黄色结晶粉末，吸收光：490~495nm，
发射光：520~530nm，明亮的黄绿色荧光。
⑵RB200：橘红色粉末,吸收光570nm，发射光
595~600nm，橘红色荧光。
⑶TRITC：紫红色粉末，吸收550nm，发射光
620nm，橙红色荧光。
⑷镧系：Eu、Tb
⑸PE：吸收光490~560nm，发射光595nm，红色
荧光。
⑹其它：酶作用后产生荧光物质。
酶作用后产生荧光物质：
酶底物产物激发光发射光
Β-GMUGMU360450
APMUPMU360450
HRPHPA二聚体317414合适荧光素的选择
⑴具有与蛋白质形成共价键的化学基团。
荧光素-N=C+NH-蛋白质荧光素-N-C-N-蛋白质
‖︱︱‖︱
SHHSH
⑵荧光效率高，标记后下降不明显。
⑶荧光色泽与背景色泽对比鲜明。
⑷标记后能保持生物学活性和免疫活性
⑸标记方法简单、快速。
⑹安全无毒
二、荧光抗体的制备

1荧光素与抗体结合（标记）
2荧光抗体的纯化
3荧光抗体的鉴定

荧光素与抗体结合方法：
⑴透析法：①适用于蛋白质含量低、样品体
积小的抗体溶液的标记
②标记较均匀，非特异荧光较低

⑵搅拌法：①适用于蛋白质含量较高、样品
体积较大的抗体溶液的标记
②标记时间短、效率较高，荧光
素用量节省
③影响因素多，非特异荧光较强
透析法

第一步：将含10mg/ml的Ig溶液10ml
装入透析袋。
第二步：将上述透析袋放入烧杯中：
含0.1mg/mlFITC的
pH=9.4的碳酸盐缓冲液100ml。
第三步：4℃磁力搅拌24h。
第四步：取出透析袋，进行纯化、鉴定。
搅拌法

第一步：将含40mg/mlBP溶液5ml
装入反应瓶中。
第二步：加入pH=9.0、0.5mol/L碳酸盐
缓冲液4ml
第三步：25℃磁力搅拌下，逐滴加入
1ml含2mg的FITC溶液
第四步：25℃下搅拌1h，4℃下继续搅拌
4h，然后进行纯化、鉴定。
荧光抗体的纯化：
⑴除去未结合荧光素
⑵除去标记不适当的抗体
⑶除去非特异反应物质
⑴除去未结合荧光素：

A透析法：
将标记后的抗体溶液装于透析袋，于流动的自来水中透析约10min，然后移入pH=7.4的磷酸盐缓冲液中，在4℃下透析，直至透析外液在紫外灯下不呈现荧光为止。B凝胶过滤法：
葡聚糖凝胶G25或G50，用pH=7.4的0.01%PBS溶胀后装柱，加入标记后的抗体溶液，然后用上述PBS洗脱，取洗脱液加入20%三氯醋酸使蛋白沉淀后，上清液中的荧光素应低于0.01ug/ml。⑵除去标记不适当的抗体：
采用DEAE纤维素离子柱。将DEAE纤维素用pH=7.6的0.01mol/L磷酸盐缓冲液平衡装柱，加入标记抗体溶液，进行分步洗脱。
未结合荧光素的抗体，所帶负电少，最先洗出。
过量结合荧光素的抗体，所帶负电多，最后洗出。⑶除去非特异反应物质：

将荧光抗体用同一正常组织或同种动物其它组织的组织粉预先吸收。
按100mg组织粉/ml标记抗体比例混合，4℃磁力搅拌1h，静置1h，离心取上清液，在用50mg/ml比例重复一次。荧光抗体的鉴定：
⑴抗体含量测定：双扩法

⑵结合比率(F/P)测定：
分光光度法，并按下式计算：
FITC:F/P=2.87×A495/(A280-0.35×A495)
RB和TRITC:F/P=A515/A280
*F/P值高则抗体分子结合的荧光素多。
*固定标本染色以F/P=1.5左右为宜
*活细胞染色以F/P=2.4左右为宜三、荧光抗体技术：

㈠抗原片的制作
㈡试验类型
㈢荧光显微镜检查㈠抗原片的制作2标本的固定：
⑴固